[发明专利]豌豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对豌豆生物资源 进行PCR鉴定用引物及使用该引物的PCR鉴定方法。

背景技术

豌豆属豆科植物，我国已有两千多年的栽培历史，现在各地均有 栽培，主要产区有四川、河南、湖北、江苏、青海等十多个省区。豌 豆的营养价值比较丰富，在豌豆荚和豆苗的嫩叶中富含维生素C和能 分解体内亚硝胺的酶，可以分解亚硝胺，具有抗癌防癌的作用。此外， 与一般蔬菜有所不同，豌豆所含的止杈酸、赤霉素和植物凝素等物质， 具有抗菌消炎，增强新陈代谢的功能。我国是一个豌豆属植物种质资 源十分丰富的国家，有许多优良品种，这些品种已成为我国许多地区 生产上大量栽培的品种，大大地促进了我国豌豆相关产业的发展。为 防止我国豌豆种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难以估量的 损失，应该加大对我国豌豆资源的保护与研究工作。

以前，豆类品种的辨别和鉴定都是根据栽培过程中的品种特征的 区别来进行的。即，通过对豆类进行长期的栽培，追踪观察其成长过 程中的特征，从而进行鉴定。这种品种鉴定方法至少需要一年。尤其， 对于近似品种的豆类，因其在形状和颜色等特征上无明显差异，不易 通过目视鉴别。另外，随着现代生物技术的出现，使基因资源更多的 是以非活体的遗传物质形式携带出境，使得口岸查验更加困难，因而 研究及建立有效的遗传资源出境检验鉴定方法以及相关的能力建设 就显得极为必要。

另一方面，利用PCR(聚合酶链反应)的基因扩增法已被广泛利 用于各个领域。PCR法是以极微量的DNA为模板，短时间内将目的 DNA区域扩增至数十万倍的方法，因其精度高而广泛被利用于医学和 微生物领域。在农产品领域中，已有利用RAPD(随机扩增多态DNA) 法对稻类品种进行鉴别的方法。而作为我国重要植物种质资源的豌 豆，目前国内外对其检测识别仅限于形态上，未见有关其分子鉴定方 法的研究。

上述用于鉴别稻类品种的RAPD法是以基因组DNA为模板，以单 个人工合成的较短的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为 引物，在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，进行PCR扩增。 扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外 透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。由 于该方法是从随机的引物中选择RAPD标记，因此，即使没有所要鉴 定品种的基因组信息也能进行鉴定。但是，该方法有如下缺点：由于 使用了各自为10个碱基对程度的较短的引物，所以退火温度较低，容 易因退火误操作而引起非特异扩增。并且，使用RAPD标记的PCR中 包括鉴定所需的特异扩增片段和多余的扩增片段，产生多个PCR产 物，因此重复性较差，鉴定需要熟练的技术。

综上所述，为了保护豌豆种质资源，需要建立一种能够对难以从 形态上进行判断的豌豆进行辨别，且适合口岸检查应用的，简单且精 确的生物鉴定方法，以此防止豌豆不会以非活体遗传物质形式等非传 统形态被携带出境。

发明内容

本发明所要解决的课题为，提供一种豌豆的PCR鉴定用引物及 PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的豌豆进行简单且精确的鉴 定。

本发明所要解决的课题为，提供一种豌豆的PCR鉴定用引物及 PCR鉴定方法，能够从原料含有豌豆的加工品以及种质资源中检测/ 鉴定豌豆。

本发明为了解决上述课题，应用PCR方法对豌豆的分子检测方法 进行研究，通过trnL序列设计特异引物，从而建立了对豌豆稳定、 高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判定 是否有豌豆核酸存在。

DNA测序技术是目前物种鉴别研究中运用最广的技术之一。而植 物谱系地理学研究中主要集中研究叶绿体DNA(chloroplast DNA， cpDNA)片段：该基因组具有分子量小、单亲遗传、多拷贝、结构简 单及碱基序列重组少等特点，有利于进行遗传分析。此外，植物叶绿 体基因的某些区域，特别是一些非编码区域存在相对较高的核苷酸置 换率，不仅适合于确定物种之间的亲缘关系，同样也适合于物种鉴别 研究。