[发明专利]螺旋粉虱特异性SCAR引物、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及螺旋粉虱特异性SCAR引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell属同翅目，粉虱科，粉虱亚科，复孔粉虱属，是一种严重危害农林业生产的入侵性害虫，加勒比区域植物保护组织将其列为A2检疫性有害生物。螺旋粉虱危害包括蔬菜、果树、观赏植物、行道树及森林等在内的90科295属481种植物，其中以番石榴、桑、榄仁、木瓜、番荔枝、樱桃、辣椒、茄子、枸杞、洋紫荆、朱槿、枫树、大理花、杜鹃花、茉莉花、圣诞红、美人蕉、猩猩草、铁苋等受害较严重。其为害方式主要有三种，包括直接吸食植物汁液致使寄主叶片提前脱落，若虫分泌大量白色蜡粉影响寄主植物外观、成虫及分泌物随风飘散引起人们厌恶及恐慌，分泌蜜露诱发霉污病、影响植物光合作用及园林植物的观赏价值并招引蚂蚁、蝇类昆虫频繁出没，不仅影响粮食作物、经济果树等的产量，而且对我国观赏植物的出口贸易构成严重威胁。

螺旋粉虱起源于中美洲和加勒比地区，1905年在马提尼克岛(属西印度群岛)的番石榴上首次记录，之后分别向东、西蔓延，陆续在古巴、巴西、厄瓜多尔、秘鲁，非洲西北角的加纳利群岛等地发现，并分别逐渐蔓延至太平洋地区及非洲西岸地区。1978年9月在夏威夷瓦胡岛的榄仁树Terminalia catappa上首次发现，并在低海拔地区大量发生。目前，螺旋粉虱已在40多个国家/地区发现，并在美国、菲律宾、马来西亚、巴布亚新几内亚、印度尼西亚、尼日利亚、多哥、贝宁、加纳、刚果、西班牙、印度等国发生危害。我国于1988年在台湾省高雄市大寮乡的番石榴植株上发现螺旋粉虱，次年蔓延至凤台市番石榴园，并快速传播扩散。当1～2年生或4～5年生的番石榴受到螺旋粉虱为害时，仅4个月，其产量损失即高达80％；当持续为害圣诞红35天时，为害率达98％，持续为害48天时全株叶片枯萎而丧失观赏价值。2006年4月螺旋粉虱在海南陵水首次发现，现已分布至除昌江县和东方市以外的全岛其他15个市县；而且，在吊罗山和尖峰岭保护区的林业局生活区内也发现了螺旋粉虱的发生，其分布常呈线状或点状。调查显示，螺旋粉虱在海南省的寄主植物种类有47科120种，包括热带果树、蔬菜、热带作物、粮食作物、观赏与园艺作物等，其中印度紫檀、番石榴、木薯、龙眼、木瓜、榄仁、美人蕉、飞扬草、野甘草等受害最为严重。螺旋粉虱是传入我国的另一种外来入侵生物，鉴于其目前仅在我国台湾和海南发现，而且一旦发生即可造成严重危害，并在我国具有进一步扩散和蔓延的趋势。而人为传播是螺旋粉虱扩散蔓延的主要方式，因此加强对螺旋粉虱的检疫和监测是杜绝其进一步传播扩散的根本途径。

螺旋粉虱体型微小，成虫体长2mm左右，初孵若虫不足0.3mm，因此加强检疫和监测必需建立一套快速而准确的分子检测方法。目前国际上用于螺旋粉虱鉴定的方法主要是：1)形态特征鉴定；2)PCR技术等。但目前国内针对螺旋粉虱尚没有标准的检测方法。

RAPD技术曾用于鉴别螺旋粉虱及其近缘种。RAPD技术检测是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在DNA聚合酶的催化下，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上根据多态性来判断检测结果。SCAR-PCR技术检测是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的之一是提供螺旋粉虱特异性SCAR引物。

本发明的再一目的是提供螺旋粉虱特异性基因片段。

本发明的再一目的是提供螺旋粉虱特异性检测方法。

本发明的再一目的是提供螺旋粉虱特异性检测试剂盒。

本发明根据螺旋粉虱特有的基因组DNA序列，设计一对特异性引物，该引物只对螺旋粉虱具有扩增能力。是对螺旋粉虱RAPD技术检测方法的补充和改进。根据本发明的螺旋粉虱特异性SCAR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：

引物ADZE：5′-AAAAACAGTTATCAAAATCG-3′。

根据本发明的另一螺旋粉虱特异性SCAR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示：

引物ADZF：5′-CGACCCTAAACTATTAACAA-3′。