[发明专利]乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应 用。

背景技术

乳链菌肽(nisin)是由某些乳酸菌菌株产生的细菌素，其可抑制多种革兰氏 阳性细菌的生长繁殖，并对人体安全无毒。目前在自然界共发现了6种nisin的天 然突变体，其中nisin A和nisin Z作为天然食品防腐剂已被广泛应用于食品行业。 Nisin A与nisin Z都由34个氨基酸残基组成，其差别仅在于氨基酸顺序上第27 位氨基酸的不同，nisin A是组氨酸(His)，而nisin Z是天冬酰胺(Asp)。

Nisin由核糖体生物合成，其翻译后修饰过程包括丝氨酸苏氨酸残基的脱水及 与半胱氨酸形成硫醚环。Nisin分子主要由两个结构域组成：N-端结构域(包括A、 B、C三个硫醚环)和C-端结构域(包括D和E两个相互缠绕的环及靠近C-端的柔性 氨基酸尾巴)，两者通过一个柔性铰链区相连接。在氨基酸构成上，N-端的疏水氨 基酸残基较多，C端则由于含有带正电荷的赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)残基而 相对亲水，这使nisin分子呈现两亲性。而NMR研究也发现nisin分子不但在氨基 酸组成上呈现两性，其N-端结构域中的A、B和C环及C-端结构域中的D和E环还 具有疏水面和亲水面的双亲结构。

Nisin不仅对引起食品腐败和对人体健康有害的许多革兰氏阳性菌有强烈抑制 作用，且其经食用后能被α-胰凝乳蛋白酶等降解，无抗药性，也不会改变肠道正 常菌群，对人体安全无毒，是一种被广泛应用的天然食品生物防腐剂。然而，随着 乳链菌肽产品的日益推广使用，人们对其生产与应用的要求也越来越高，例如，乳 链菌肽抑菌谱较窄，只能抑制革兰氏阳性菌，且只在物理(脉冲电场)或化学(EDTA) 处理条件下才能抑制革兰氏阴性菌；乳链菌肽只在低pH条件下表现较高稳定性和 溶解度，而在高pH条件下溶解度低也不稳定，易裂解失活等等。因此，在研究乳 链菌肽的生物合成途径、代谢调控及其作用机制等基础上，利用微生物代谢工程、 基因定点突变等手段，对乳链菌肽进行改造和优化，将很好地改善乳链菌肽产品性 能，扩大乳链菌肽产品应用范围，提升产品竞争力。近年来，国内外研究者对乳链 菌肽分子的结构与功能开展了较多的探索，主要是针对硫醚环的部分氨基酸进行了 定点突变研究，但大多是负结果，只有铰链区氨基酸残基的定点突变取得了一些正 面结果(Yuan J et al.Applied Microbiology and Biotechnology 64：806-815)。 对nisin分子C-端的柔性氨基酸尾巴研究和关注较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳链菌肽突变体蛋白，该蛋白与野生型乳链菌肽相 比，具有更广的抑菌谱以及更高的稳定性。

本发明提供的乳链菌肽突变体蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组 成的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

上述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第313位到第417位所示的基因；

2)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第244位到第417位所示的基因；

3)在严谨条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码上述的蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。

上述严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者 RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是将含权利要求2或3所述基因的片段插入pMG36e的多克隆位 点之间，得到重组表达载体；

所述含权利要求2或3所述基因的片段的核苷酸序列如序列表中序列1自5’ 端的第1位到第463位所示。

含有上述基因的重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌是将上述的重组载体导入乳酸菌中得到的重组乳酸菌；所述乳酸菌 是L.lactis NZ9800。

上述的重组菌在生产上述乳链菌肽突变体蛋白中的应用也属于本发明的保护 范围。

本发明的又一目的在于提供一种抑菌剂。所述抑菌是抑制革兰氏阳性菌。