[发明专利]一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的表达载体pDXW-8，其特征在于：

含有用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacI^PF104，从6985到5903位，其携带的外源启动子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列为cagcgtattt gaccgatccg gacacctggg ataatgtgtg gattttgtcg gtg gtgaat，其中划线部分为启动子PF104序列，加框部分为SD序列；

含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点MCS，从9546位到9472位，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII，其核苷酸序列为gaattcgctagcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt。

3.如权利要求1或2所述的表达载体pDXW-8的构建方法，其特征是：

以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的kan基因，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶SgrAI酶切位点，PCR产物用SgrAI酶切；pKK223-3同样用SgrAI酶切，用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；两者连接，由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5；

以质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的rep片段，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶PshAI酶切位点，PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5，由此产生的质粒大小为8313bp，命名为pDXW-6；为了证明rep片段和kan基因在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，并选择卡那霉素抗性克隆；

以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列的正向引物lacI-F，和反向引物lacI-R为引物，通过PCR扩增1191bp的lacI^PF104基因，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点，PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-6，由此产生的质粒大小为9510bp，命名为pDXW-7；

人工合成的74bp多克隆位点MCS的DNA片段5′gaattcgcta gcgagctcccatgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt 3’，它包含有11个单一的限制性内切酶切点：EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII；用EcoRI和HindIII双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW-7上，取代pDXW-7原有的多克隆位点，对该构建质粒的MCS及其两翼进行测序，以验证MCS正确连接到pDXW-7上，构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8；

以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对kan/rep-D/kan-F，kan/rep-D/kan-R，kan/rep-D/rep-F，kan/rep-D/rep-R，lacI-D/lacI-F，及lacI-D/lacI-R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒pDXW-8上kan基因插入方向为正向插入，rep和lacI^PF104片段的插入方向均为反向插入；

以上所述的PCR扩增所需引物序列：

kan-F：agcacaccgg cgctttgatc ttttctacgg ggtc

kan-R：agcacaccgg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaa

rep-F：agtagactat cgtccattgt caacaacaag acccatca

rep-R：agtagactat cgtcgtctac gtctgatgct ttgaatcg

lacI-F：gctgtatacc agcgtatttg accgatccgg acacctggga taatgtgtgg attttgtcgggaaaggatgg tgaatatgaa accagtaacg

lacI-R：gtatacggtg cctaatgagt gagctaactt

Kan/rep-D：ctcacaattc cacacattat acga

lacI-D：acacggaggc atcaagtgac caaa

PCR反应条件：

扩增kan基因PCR反应：所用引物为kan-F，kan-R；退火温度57℃，延伸时间75s；

扩增rep片段PCR反应：所用引物为rep-F，rep-R，退火温度61℃，延伸时间165s；

扩增lacI^PF104基因PCR反应：所用引物为lacI-F，lacI-R，退火温度59℃，延伸时间75s；

确定kan基因正向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，Kan-R，退火温度57℃，延伸时间75s；

确定kan基因反向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，Kan-F，退火温度57℃，延伸时间75s；

确定rep片段正向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，rep-R，退火温度57℃，延伸时间255s；

确定rep片段反向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，rep-F，退火温度57℃，延伸时间255s；

确定lacI^PF104基因正向插入PCR反应：所用引物为lacI-D，lacI-R，退火温度59℃，延伸时间105s；

确定lacI^PF104基因反向插入PCR反应：所用引物为lacI-D，lacI-F，退火温度59℃，延伸时间105s。