[发明专利]表达嗜热子囊菌光孢变种tapro基因的毕赤酵母工程菌株

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus热稳定丝氨酸蛋白酶基因tapro的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-TAPRO-18。

(二)技术背景：

蛋白酶又称蛋白水解酶，是催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称，它作用于蛋白质，将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸，与淀粉酶、脂肪酶并称三大酶类，不仅参与生物体的新陈代谢，而且与人们的社会生产和生活需求密不可分。

按照国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会的规定，蛋白酶属于第3大类水解酶类、4亚类肽水解酶，是一类复杂的水解酶。按催化机制，特别是根据酶活性中心起关键作用的催化基团，可将其分为四大类：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶。

蛋白酶是一类在生理学和商业领域中具有广泛应用价值的酶，其在食品和清洁剂中的应用具有悠久的历史。微生物来源的蛋白酶，由于培养简便，产量丰富，适于工业化生产而得以广泛应用。但一般的蛋白酶热稳定性较差，在应用中易于失活，因此热稳定性蛋白酶的研究和开发具有重要的商业价值。对于热稳定蛋白酶性质和结构的研究已经成为当前蛋白酶研究的热点问题。

嗜热子囊菌光孢变种(T.aurantiacus var.levisporus)是一种生长上限温度较高的嗜热真菌，能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。其以酪蛋白为诱导物培养可分泌蛋白酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热子囊菌光孢变种培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热子囊菌光孢变种热稳定丝氨酸蛋白酶基因导入酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定丝氨酸蛋白酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

(三)发明内容：

本发明从嗜热子囊菌光孢变种获得丝氨酸蛋白酶基因tapro的全长cDNA，命名为tapro(EU364816)，嗜热子囊菌光孢变种tapro全长的cDNA为1837bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框(ORF)部分为1485bp，编码494个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，该蛋白酶为丝氨酸蛋白酶枯草杆菌S8家族，含有Asp183/Ser384/His215催化三联体，并具有枯草杆菌蛋白酶家族的保守区DTG、DG-GHGTH和GTSMA-PH。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/tapro，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TAPRO-18。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在30℃250rpm/min摇床培养7d后，丝氨酸蛋白酶表达量为1.15mg/mL，分子量为59kDa，酶在60℃是稳定的，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为50min，具热稳定性，在工业和生物学领域具有广阔的应用前景。

(四)附图说明：

图1丝氨酸蛋白酶基因tapro PCR产物电泳图谱

泳道M：Marker-DL5000

泳道1：cDNA(ORF)

图2丝氨酸蛋白酶TAPRO的SDS-PAGE分析

(a)泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1-7：酵母工程菌Pichia pastoris GS-TAPRO-18的诱导1-7天的表达情况

泳道8：转化pPIC9K质粒的酵母菌株发酵液

(b)泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1、2：纯化的重组丝氨酸蛋白酶TAPRO

(五)具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种T.aurantiacus var.levisporus的分离鉴定

(1)标本采集：从堆肥中采集。

(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

(3)鉴定：参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：丝氨酸蛋白酶基因tapro的克隆