[发明专利]大豆疫霉PCR检测特异引物对

说明书

技术领域

本发明涉植物保护领域，提供了利用PCR扩增技术对大豆疫霉的检测，适用于 植物保护、口岸检验检疫机构应用。

背景技术

由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)侵染大豆引起的大 豆疫霉病(Soybean Phytophthora Root Rot)是大豆生产上的毁灭性病害之一。在美 国、加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亚、英国、匈牙利、尼日利亚、印度、 埃及、以色列、南非、德国、瑞士、新西兰等国家相继报道了该病害的发生。目前 大豆疫霉病在我国的局部地区也有发生，在黑龙江省部分地区大豆疫霉病的发生报 道，在北京，山东，安徽，蒙城，内蒙古也随后相继分离到了病原菌。近年来，随 着大豆种植面积的不断扩大和引种，大豆疫霉病在我国的发生也日趋严重，而且发 病面积有加大的趋势。大豆疫霉病已经成为我国大豆生产上主要的威胁之一。1986 年大豆疫霉被我国确定为I类进境植物检疫对象，目前全世界每年因为大豆疫霉病 造成的经济损失大约为10亿美元。

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、无放射性污染、易推广等等突 出特点，在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技 术，在检验检疫领域也获得了广泛应用，建立了多种检疫性有害生物的PCR检测方 法，如柑桔黄龙病菌、柑桔溃疡病菌、梨火疫病菌、小麦印度腥黑穗病菌、大豆疫 霉、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等等。

目前大豆疫霉的分子检测方面，南京农业大学注册了“大豆疫霉的检测试剂盒 及其检测方法(专利号：03131531.3)”、东北农业大学注册了“大豆疫霉菌的检测 方法及专用引物(专利：200610089105.4)”、福建省农业科学院植物保护研究所注 册了“一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒”等等三个专利，以上 这些专利都是以核糖体转录间隔区(ITS)序列差异设计，本发明设计的A引物为基 于微观蛋白基因(β-tublin)序列差异设计的引物，本专利的发明的引物序列与前 几个专利的引物序列都不相同。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供用于检测大豆疫霉的PCR特异引物。

本发明用于检测大豆疫霉的PCR引物序列为：

上游引物(F)：5’-CGAGCTTATCGACTCGGTT-3’

下游引物(R)：5’-TTCTCAACGAGCTGGTGG-3’

用引物对待测样品进行DNA扩增，如果结果产生一条250bp大小的特异谱带， 则该样品含有大豆疫霉，如果结果没有出现单一特异大小谱带，则样品中不含有大 豆疫霉。

附图说明

图1.大豆疫霉特异引物检测结果

泳道为苜蓿疫霉根腐病菌，均能扩增出梯状DNA条带，泳道为对照，而未出现 条带。

具体实施方式

引物设计：

根据大豆疫霉特异β-tublin序列，用Oligo 6.0软件设计大豆疫霉的特异引物对。

001AACTTCGTGT TCGGCCAGAC GGGCGCCGGT AACAACTGGG CCAAGGGACA CTACACGGAG

061GGTGCCGAGC TTATCGACTC GGTTCTCGAC GTCGTCCGCA AGGAGGCTGA GAGCTGTGAC

上游引物(F)

121TGCCTTCAGG GTTTCCAGAT CACGCACTCG CTGGGTGGCG GTACCGGTTC CGGTATGGGT

181ACGCTTCTTA TCTCCAAGAT TCGTGAGGAG TACCCGGACC GTATCATGTG CACGTACTCG

241GTCTGCCCGT CGCCTAAGGT GTCGGACACG GTCGTCGAGC CCTACAACGC TACGCTGTCC

301GTCCACCAGC TCGTTGAGAA CGCCGATGAG GTCATGTGCC TGGATAACGA GGCCCTGTAC

下游引物(R)

361GACATTTGCT TCC

试剂和设备