[发明专利]鸡传染性喉气管炎病毒的HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合核酸疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合核酸疫苗及其制备方法。

背景技术

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病，呈全球性流行，是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强，可以在鸡体内潜伏感染，而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此，研制更安全而有效的疫苗，将有利于彻底控制乃至根除ILT。

核酸疫苗技术作为一种新的免疫接种手段问世不久就在感染性疾病及肿瘤的防治中显示出巨大的潜力。所谓核酸疫苗，就是将含有可表达的病原微生物的抗原基因整合到某种适宜的质粒DNA中，置于真核表达元件的控制之下，构成重组质粒DNA，然后将这种编码某种抗原蛋白的基因质粒DNA直接注射到动物体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。能诱导动物机体产生免疫效应的真核表达载体质粒可称为基因疫苗(genetic vaccine)或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)，它是继病原体疫苗、亚单位疫苗之后的第三代疫苗。在1994年5月的世界卫生组织大会上，与会专家充分肯定了核酸疫苗应用的潜在价值，并认为核酸疫苗的研究发展与未来实施的用一种疫苗预防多种传染病的计划是一致的。大量的实验结果表明，核酸疫苗不仅可用于人类疾病，而且还可广泛应用于人畜共患病和动植物疾病。它不仅对预防疾病有作用，还能治疗疾病。因此，在不久的将来，核酸疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。

以往的传统疫苗在疫病防治上曾作出了辉煌的成就，如英国医生Jenner用牛痘苗(1798)预防天花并获得成功，但传统的减毒、灭活疫苗的潜在致病性和亚单位疫苗免疫反应的不完全性迫使人们继续寻找更为理想的免疫接种剂。近年来，一种诱导免疫应答的新手段即基因免疫正在悄然兴起，目前它已经成为国际疫苗学及生物学研究领域的热点，其研究范围越来越广，研究程度也日渐深入。世界上第一例DNA疫苗是用于治疗艾滋病的HIVDNA疫苗，1996年已批准在健康人身上进行I期临床试验。

DNA疫苗由病原抗原编码基因及载体质粒两部分组成。抗原基因可以是单个基因或完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。对载体质粒的一般要求是：1)在大肠杆菌中可以高拷贝地复制；2)在动物细胞内高效表达，但不能含有促进整合入宿主细胞染色体基因组的序列。DNA疫苗一般以载体质粒为基本骨架，带有细菌复制子和真核生物的启动子，有的还含有增强子和多聚polyA加尾信号。启动子多采用CMV、SV40、RSV、LTR及β-actin启动子序列，它们都具有较高的转录活性，在多种动物细胞中能高效表达。以CMV的转录活性最高，其中又以带intronA的转录活性最好，intronA内部含有某些转录因子的结合信号，可能是促进转录的原因。还采用在质粒中加入增强子序列、终止/加工元件、促T细胞激活的共刺激分子及细胞因子等手段来提高DNA疫苗的免疫刺激作用，免疫增强效果。虽然强启动子可以产生较好的表达及免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。

外源基因在启动子作用下表达相应的蛋白，表达产物在细胞内被降解成为若干短肽，这些短肽含有不同的表位，分别与MHC-I类和MHC-II类分子结合，并提呈给CD8⁺和CD4⁺T细胞，从而诱导细胞免疫应答和体液免疫应答。与MHC-I类分子结合的短肽激活CD8⁺T细胞(CTL)，与MHC-II类分子结合的短肽则激活CD4⁺T细胞，产生大量的抗体外源基因直接在宿主体细胞内表达和加工，能完整保留产物的天然结构和抗原性，而且抗原在细胞内的表达与病毒自然感染过程一致，这对于构象依赖型抗原表位诱发中和抗体的产生极为重要。DNA疫苗诱导的Th1反应产生与补体结合的IgG亚类，可活化吞噬细胞(单核细胞、巨嗜细胞和嗜中性细胞)，与补体结合抗体共同抵抗入侵的细菌和病毒；Th2反应产生IgG和非补体结合性Ig亚类，活化非吞噬性细胞(如肥大细胞)的防卫反应，对控制蠕虫和黏膜免疫更有效。

在基因免疫中外源质粒DNA起到疫苗作用，并能模拟病原体胞内自然感染过程，使表达的外源蛋白以自然加工形式递呈给免疫识别系统，从而有效地诱导全方位的免疫应答。因此，用基因免疫技术研制的DNA疫苗，与传统方法研制的疫苗相比具有以下特点：