[发明专利]转基因木瓜品系18-2-4的核酸分子及其检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系18-2-4的核酸分子。本发明也涉及应用前述序列的一种用于检测对于木瓜环斑病毒具有广泛抗性的转基因木瓜品系18-2-4的方法，以及依据前述序列所设计出的引物、探针及试剂盒。

背景技术

木瓜(Papaya)(Carica papaya L.)生长于热带与亚热带地区。量产木瓜所面临的最大问题是在于木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus，PRSV)造成的破坏性疾病(Purcifull et al.1984)。1975年，PRSV首次在南台湾地区发现(Wang et al.1978)，至今已经摧毁了商业果园大部分的木瓜生产。PRSV是属于马铃薯Y群病毒(Potyvirus)的一员，此族群病毒是最庞大且影响经济甚巨的植物病毒族群(Fauquetet al.2005)。PRSV可以通过蚜虫传递并且诱发叶部斑点以及变形、茎杆条纹以及生长停滞的发生，而导致果实品质及产量的骤减(Purcifull et al.1984)。

目前被使用来保护木瓜免于PRSV感染的控制措施，主要包括：选择种植时间，以避开蚜虫生长高峰期；使用银色覆盖物(silver mulch)，以驱离蚜虫远离种苗；以及应用减弱的PRSV病毒株的交叉保护作用(cross protection)(Yeh et al.1988；Yehand Gonsalves，1994)。然而，这些方法皆无法提供对抗PRSV的长期有效的保护。目前在台湾，将木瓜种植于网室内已经变成用于避免木瓜遭受经蚜虫传递的PRSV感染的最有效的控制方法。然而，网室构筑需要较高的成本，且所使用的塑料材料于自然中难以分解，这将会对环境造成危害，且热带风暴造成损害的高度风险亦为需要考量的重要问题(Bau et al.2003)。

近年来，以病源体衍生的抗性(pathogen-derived resistance，PDR)的观念(Sanfordand Johnson，1985)为基础，含有植物病毒基因组片段的转基因植物的研发已经广泛地被使用作为控制病毒的对策(Beachy，1997)。在大部分的实例中，会产生后转录性的抗性(posttranscriptional resistance)机制，这是因一种以序列特异性方式针对病毒的RNA以及转基因mRNA降解的RNA调节路径所致(English et al.1996；Lindboet al.1993；Sijen and Kooter 2000；Vaucheret et al.1998)。PRSV的外壳蛋白(coatprotein，CP)基因通过粒子轰炸法(particle bombardment)予以转移至木瓜中(Fitch etal.1990)，并且筛选出对PRSV感染具有高度抗性的转基因品系(Fitch et al.1992；Lius et al.1997)。

转基因木瓜自1998年起已成功地于夏威夷商业化(Gonsalves，2002；Tripathi etal.2007)。在台湾，带有台湾严重病毒株PRSV YK的CP基因的转基因木瓜品系则通过农杆菌媒介的转化方法(Agrobacterium-mediated transformation)已成功的被制造出(Cheng et al.1996)。当前述转基因木瓜被接种予PRSV YK时，它们对病毒的反应落在高度易感性(high susceptibility)到具有完全抗性(complete resistance)的范围内(Bau et al.2003)。在温室条件下，转基因品系16-0-1、17-0-1、17-0-5以及18-2-4对于源自不同地理来源的PRSV具有广泛的抗性(Bau et.al.，2003)，而于田野试验中则有高度的抗性(Bau et al.2004)，显示这些品系具有控制不同地理区域中的PRSV的能力。

实验观察发现16-0-1、17-0-5以及18-2-4于植株生长至5公分高度时，会表现高度的转基因，然而其他诸如18-0-9、19-0-1则于相同阶段完全没有表现，可见16-0-1、17-0-5以及18-2-4等转基因木瓜品系中的转基因插入于基因组的位点必然有其特殊性。现有技术尚无法得知前述转基因木瓜品系，特别是转基因木瓜品系18-2-4的转基因插入位置旁侧的基因组序列，若能了解其插入基因组位置，将可针对各种品种的木瓜直接进行诸如以同源性的基因重组有效率的产生具有抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系，而无需经由长时间的筛选以及田间试验，以取得高抗病毒性的木瓜品系。