[发明专利]橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生体胚植株的方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)属橡胶树属大戟科，是热区广泛种植的重要经济作物，因其胶乳产量高、质量好、易于获取而具有商业开发价值，成为世界上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生乔木，常规育种周期长，选育种受到很大的限制。为了拓宽巴西橡胶树育种途径，改良其品质，从上个世纪50年代以来，橡胶育种学家们即开始着手研究其组织培养技术，特别是上个世纪70年代以来，我国、马来西亚、法国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡等国投入大量的人力、物力、财力对这项技术进行广泛的研究，目前在花药培养、未授粉胚珠和子房培养、茎尖及嫩茎培养、悬浮细胞培养、原生质体培养、体细胞植株的克隆增殖和遗传转化等方面都取得了一定的进展。

花药和内珠被培养是巴西橡胶树组织培养中研究较早和较多的方向，其基本过程是：1)拨取橡胶处于单核晚期的雄花花药或切取幼嫩橡胶树种子的内珠被进行脱分化培养，约30～60天；2)将形成的脱分化愈伤转入橡胶胚诱导培养基，进行胚诱导培养过程，约3～4个月；3)经胚诱导过程后，会从部分脱分化愈伤上形成胚性愈伤，胚性愈伤经进一步发育会逐步形成棒状、心形、鱼雷形胚(以上为成熟胚)等，这些都是胚性组织；4)将成熟胚依次转入芽诱导和根诱导培养基内进行芽和根的培养，当长到适宜高度后再转入自然环境锻炼和定植。

迄今，我国花药和内珠被植株的大田栽培面积已有近千亩，与传统的芽接苗相比，花药和内珠被植株植株具有生长速度快、干胶产量高、抗逆性强的特点，未来可能成为主要的种植材料。目前，花药和内珠被植株培养中存在的主要问题是：外植体取材受橡胶开花和结果时间的限制，脱分化愈伤成胚率低且难以长期继代保存，因而植株再生频率低，生产成本高，后期靠体胚植株茎段微繁技术也很难满足生产中对组培苗的大量需求和建立高效遗传转化体系等生物技术实验的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，它是选择适宜的子叶胚进行切片处理诱导高效的胚性愈伤，由胚性愈伤再诱导出大量子叶胚，并成苗的过程，该方法能大量长期继代增殖保存良好的胚性材料，大大提高了橡胶树的组织培养效率，为生产和实验提供了良好的再生体系方法。

本发明所采用的技术方案：

一种橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程、高效胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程。

1、胚性组织的选取与处理过程：在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康，长1cm以上的子叶胚为外植体，进行切片处理，切成宽2～3mm、长3～5mm的米粒状切片。切片的质量影响愈伤诱导效率，切片过小，难以诱导出愈伤，切片太大浪费材料的同时也难诱导出理想的愈伤。

2、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程：将米粒状子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于26～28℃进行暗培养20～40天。其中20～30天的愈伤出胚效率最高，体胚愈伤在胚诱导培养基上培养45天后观察，出胚愈伤率可达40～60％，出胚率可达200～300％，20天以前的愈伤量很少，40天以后的愈伤出胚效率明显降低，都不宜选择为胚诱导的愈伤材料。所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0.5～2ppm 2，4-D、0.5～2ppm KT、0～1ppm BA、0～2ppm NAA、0～2ppm ZT、蔗糖70～90g/L、椰子水50ml/L、0.1～2g/L天门冬酰胺和0.1～0.2g/L肌醇。

3、高效胚性愈伤诱导成胚过程：将步骤2得到的脱分化愈伤接到胚诱导培养基上于24～26℃进行暗培养。20～30天可观察到体胚的发育过程，40～60天时能大量形成子叶胚。这些子叶胚长到1cm以上时便可进一步切片诱导高效胚性愈伤进行体胚的循环增殖，或者接入成苗培养基内诱导形成自根苗。所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10～50％，微量元素增加0.5～2倍，并添加0.5～3ppm BA、0.5～3ppm KT、0～0.5ppmNAA、0.2～1ppmGA、0～.5ppm ABA、水解酪氨酸50～300mg/l、加0.1～0.2g/L肌醇、麦芽糖0～20g/L、蔗糖50～70g/L和椰子水50ml/L。