[发明专利]多重荧光定量RT-PCR同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒

说明书

发明领域

本发明属于生物技术应用领域。本发明是用基于多重荧光定量RT-PCR技术同时检测人新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院对人新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的同时检测和监测。

发明背景

新甲型H1N1流感(原称人感染猪流感病毒)是一种新的甲型H1N1病毒引起的急性呼吸道传染病，具有较强的传染性，可通过近距离飞沫和接触传播，这种新型病毒是美国于2009年4月在人体中首次检出的。随后，该病毒在世界范围内蔓延开来。序列研究表明，该病毒是由人、禽和猪源流感病毒重配的产物。目前，人们对该病毒的毒力、传染性等特征有限的认识使得开发快速检测及分型技术来筛查可疑病例，从而实现对疫情蔓延的控制以及及时的抗病毒治疗显得尤为迫切。

早期有关流感病毒分型研究使用荧光定量RT-PCR、芯片、流式细胞仪和测序等方法做为终端检测系统，但这些方法大多不能检测新甲型H1N1流感病毒。尽管有些方法得到进一步发展，但仍依赖于昂贵的设备，并且灵敏度也不高。目前已经开发了四种荧光定量RT-PCR技术包括HPA(H1)v(英国卫生防护机构)、CDC(H1)v(美国疾控中心)、HPA(N1)v(英国卫生防护机构)和S-OIV(国家病毒参比实验室，爱尔兰)虽然可以检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒，但这些方法都是多管多重荧光定量RT-PCR，操作繁琐，时间较长，成本较高。国内达安基因公司和科华公司等开发的荧光定量RT-PCR检测新甲流的试剂已得到了中国FDA的批准，不过这些方法都没有包括检测季节性H3N2，不能实现单管同时检测2种季节性流感和新甲型流感。本专利成功建立了一套4重荧光定量RT-PCR方法可实现单管同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒、人季节性H3N2流感病毒，并对该法的特异性和灵敏度做了分析，整个反应不到2个小时。利用阳性临床标本进行验证，结果表明该方法和WHO推荐的方法的检测结果完全符合。这将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。

发明内容：

1.以WHO公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用CLUSTAL X软件进行序列比对，选取对于针对各个靶病毒高度保守而对于其它型别高度特异的基因区段，由Primer Premier5设计四重引物和探针，如表一：

表一  各引物和探针序列

TABLE 1.RT-PCR Primers and probes designed for this study

^a：Degenerate primer abbreviations are as follows：R＝A/G；Y＝T/C；M＝A/C.

2.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成探针：使用北京英杰生命技术有限公司合成仪合成并纯化。

(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。

(3)4重荧光定量RT PCR反应。

(4)阳性反应结果以Ct值小于或等于35判定。

具体实施方式

实施方案1：多重荧光定量RT-PCR的反应体系和条件

按Qiagen试剂盒说明提取不同来源和亚型的流感病RNA。建立Bio-Rad荧光定量RT-PCR一步法反应体系(25μl)，组成如下：RTase 0.5μl，itaq mix 12.5μl，itaq酶0.5μl，RNA模板4μl，sH1N1、sH3N2、nH1N1和RnasP的引物和探针浓度分别为1.6μmol/L，1.6μmol/L；0.2μmol/L，0.2μmol/L；0.4μmol/L，0.4μmol/L；0.08μmol/L，0.08μmol/L。反应条件为：50℃ 30min合成cDNA，然后95℃ 5min条件下灭活iScript逆转录酶。50个循环的PCR包括95℃ 15s、60℃ 30s，最后用CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)读板。

实施方案2：多重荧光定量RT-PCR的特异性