[发明专利]一种抗黄曲霉花生种皮RNA提取与荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种抗黄曲霉花生种皮RNA提取与荧光定量PCR检测方法。

背景技术：

植物具有坚硬的细胞壁，同时细胞内富含单宁、萜烯、色素、酚等次生代谢物以及蛋白质、多糖等生物大分子。细胞破碎后这些物质被释放出来，以不同方式干扰RNA的提取，如酚类物质氧化后可使RNA活性丧失，多糖可形成难溶胶状物质与RNA一起被沉淀等。另外，在植物细胞破碎后，植物本身的RNA酶(RNase)以及操作体系中的RNase均会对mRNA进行降解，并且RNase极为稳定，在实验操作中很难将它们彻底除去。对于不同植物、不同组织或不同生理状态下的植物材料其细胞与组织的成分各不相同，因此，必须针对不同植物组织的特点，慎重选择不同的提取方法，同时尽量避免上述因素对RNA提取的影响。

在分子生物学研究中，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行许多分子生物学实验的前提，也是基础实验之一，如RT-PCR、RACE、Northern印迹、荧光定量PCR和构建cDNA文库等实验成功与否，在很大程度上取决于RNA的质量。花生种皮是花生抵御黄曲霉侵染的首要屏障，也是克隆抗病基因的重要材料，从花生种皮中提取高质量的RNA是克隆花生种皮中抗病基因的重要前提。以花生种皮为材料提取RNA会遇到很大的困难。花生是地上开花地下结果的植物，花生种皮会随着时间而变得越来越薄，越来越不容易剥取且量越来越少，在取样过程中要保证组织细胞的RNA完全不降解，有一定的难度；花生种皮富含多糖、酚类化合物以及一些成分复杂的次级代谢产物，更重要的是花生种皮发育过程中伴随着成熟期的临近，RNA含量越来越少，因此在提取过程中要最大限度地抑制RNase的活性，并快速去除各种代谢产物，以保证提取样品的完整性与纯度及之后逆转录的活性等。研究如何抑制来自材料本身内源RNase的同时，更要注意外源RNase的污染。

目前提取植物总RNA的方法很多，包括强变性剂法、苯酚法、阴离子去污剂法、LiCL-尿素法、CTAB法、热硼酸法等。这些方法各有各的优点，但由于上述原因，这些方法都不适合花生种皮RNA的提取。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抗黄曲霉花生种皮RNA提取与荧光定量PCR检测方法，它提取的RNA质量好，可用于大量提取花生种皮RNA，且可用于荧光定量PCR。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：1、于冰上5mL离心管中加入预冷1mL(可以多加)裂解液(964μL裂解液+36μL巯基乙醇)；2、从液氮中迅速取出适量(两到三个花生的种皮即可)花生种皮在液氮中充分研磨至粉末，倒入0.1g的粉末至离心管中，充分涡旋使之混匀；3、加入0.1mL 2M NaAc(pH4.0)混匀，加入1mL水饱和酚，充分振荡使之混匀，加入0.4mL的氯仿/异戊醇(49∶1)剧烈震荡混匀；4、冰浴10min后在4℃，12000rpm条件下离心15min；取上水相(千万不要吸到杂质)，加入到另外处理好的离心管中；5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，充分震荡混匀。重复4和5直至蛋白消失；6、冰浴10min后在4℃，12000rpm条件下离心15min；取上水相(千万不要吸到杂质)，加入到另外处理好的离心管中；7、加入1/2体积的10M的LiCL(最终浓度为2.5M)和0.1倍体积异丙醇混匀；-20℃沉淀过夜后4℃，12000rpm条件下离心20min；8、沉淀溶于300μLDEPC水(可适量增加)，加入0.1倍体积5M NaAc(pH5.2)和1倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min以上后4℃，12000rpm条件下离心15min(若有沉淀，可继续步骤6，LiCL不用再次加)；9、70％乙醇洗涤沉淀2次，每次静置2min，4℃，12000rpm条件下离心5min，室温晾干5min；沉淀溶于30μLDEPC水，分装后检测，-80℃保存。

本发明具有以下有益效果：提取花生种皮RNA看似过程所需时间较长，实际只需3个小时左右(过夜沉淀不算在内)，所需试剂用量少，可多个样本同时大量提取。同时，提取所用样品少，两到三个花生的种皮即可提取1管经电泳检测亮度大、浓度高的RNA。

具体实施方式：