[发明专利]一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵过程中的补料方法，尤其是一种提高谷氨酰胺转胺酶发 酵过程中溶氧的补料方法。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质 本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白 质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应 用前景。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株 (Streptomyces hygroscopicus CCTCC No.M203062)，对其进行了发酵条 件优化以及探讨了MTG由酶原到成熟酶的活化机制。研究室的前期研究结 果表明，MTG在营养菌丝的的生长阶段并不分泌，而是在分化形成气生菌 丝时才开启动和分泌，因此提高菌体量，对于促进产酶有很重要的作用。

流加技术是能控制或改变培养基中的一种或一种以上的营养成分的浓 度，这样在细胞生长或产物形成对底物浓度受限敏感的工艺过程中使用比 较理想，还可以做到用较确定的营养成分来代替复杂的营养源流加培养是 提高菌体浓度的传统方法。对于利用补料发酵生产MTG，已有报道(许晓 娟.吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究.中国生物工程杂志， 2009，29(5)：78-82)，通过流加碳源提高酶的产量，取得一定效果，但是该 方法存在一个问题，补加碳源导致发酵液黏度较大，溶氧水平较低，限制了 菌体的生长和产酶。本发明利用补料的方式降低发酵液黏度，未见文献报道。

发明内容

针对谷氨酰胺转胺酶发酵过程中溶氧较低的问题，本发明所要解决的技 术问题是提供一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法，提高了菌体的生 物量和谷氨酰胺转胺酶的产量。

为解决上述问题，本发明提供的谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方 法，是在菌体生长期流加碳源和有机氮源的混合液；谷氨酰胺转胺酶发酵过 程中，单独流加碳源提高菌体的生物量，单独流加有机氮源避免谷氨酰胺转 胺酶将发酵液中未利用的氮源交联，导致发酵液粘稠，将这两种技术结合， 提高了发酵液中溶氧水平，菌体生物量和谷氨酰胺转胺酶的产量都相应提 高。

本发明技术方案的原理如下：在吸水链霉菌发酵过程中，谷氨酰胺转胺 酶会使发酵液中蛋白质氮源交联，导致发酵液黏稠，严重的影响了溶氧水平， 对于微生物生长有很大影响，进而影响酶的产量。本发明通过降低初始发酵 培养基中的氮源浓度，减轻了因蛋白质氮源作为反应底物被交联而引起的发 酵液粘稠现象，通过流加氮源、碳源的方法为菌体生长和产酶提供营养。发 酵前期，营养菌丝生长，MTG并不分泌，8小时后，菌体开始分泌谷氨酰 胺转胺酶，在此期间通过流加一定碳氮比的营养液的方法，提高菌体生长期 溶氧水平及底物利用效率，提高MTG产量。

所述的方法中，生产菌株可为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、茂原链霉菌(Streptoverticilluim mobaraense)，其中优选 菌为吸水链霉菌菌种(Streptomyces hygroscopicus)由武汉中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No.M203062，该菌种在(谷氨酰胺转 胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，专利号 ZL03152956.9)中公开。

所述的方法中，微生物优选培养基为：斜面培养基(g/L)，麦芽汁50(10 oBe)，酵母膏5，葡萄糖5，琼脂20，pH 7.0；种子培养基(g/L)，玉米淀粉 20，蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二 氢钾2，pH7.0；初始发酵培养基(g/L)，葡萄糖10，蛋白胨10g，酵母膏5g， 无水硫酸镁2g，磷酸氢二钾3.75g，无水磷酸二氢钾0.25g，碳酸钙5g， pH8.0。

所述的方法中，微生物培养条件为，接一铲生长良好的斜面培养物至装 有100mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇瓶转速为200r/min，温 度32℃，培养时间24h。以6％的接种量接入3L全自动发酵罐(LiFlus GM BioTRON，Korea)中，装液量为1.5L，设定通气量1.25vvm，搅拌转速700 r/min，温度控制在32C，对发酵过程的pH不进行控制。