[发明专利]一种改进的硝化细菌Diphenylamine-Griess检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境化学领域和环境微生物领域，具体地说是一种改进的硝化细菌Diphenylamine-Griess检测方法。

背景技术

显色反应是化学和生物学中用来检测化学物质常用的一种技术。硝化细菌培养液中NO₃^-的检测，其核心内容是培养液中NO₂^-的完全彻底去除。针对这一问题，前人做了很多尝试，效果不够理想。硝酸细菌检测时，显色剂二苯胺(Diphenylamine)对NO2-和NO₃^-的专一性不够，与NO₂-和NO₃-反应都会呈现蓝色，因此，培养基中剩余的NO₂^-会影响测定结果。即使培养基中NO₂-的原始浓度为0.1mmol/L，在不能保证NO₂^-被完全转化的条件下，也应进行去除NO₂^-操作。

现已报道的除培养物中NO₂^-的方法有：在培养物中加入醋酸5～8滴使之酸化，再加入数粒磺胺酸(对氨基苯磺酸)；当停止放气时，再加入一粒磺胺酸，此过程中NO₂^-转化为N₂而逸去。加Griess试剂，如不呈红色，证明NO₂^-已除净。再分别滴加两滴浓硫酸和二苯胺(Diphenylamine)试剂，如呈蓝色，即证明有NO₃^-存在。但是在试验过程中使用醋酸5～8滴并不能保证NO₂^-完全转化为N₂，所有试管加入Griess试剂后均呈现红色，说明有NO₂^-残余。

发明内容

本发明的目的在于克服培养液中NO₂^-不能完全彻底去除的困难，提供一种能够完全去除培养液中NO₂^-的改进的硝化细菌Diphenylamine-Griess检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

改进的硝化细菌Diphenylamine-Griess检测方法：在培养有硝化细菌的培养液中首先加入5～8滴盐酸使培养液酸化，再加入氨基磺酸铵，于50-60℃反应直至培养基颜色为无色，培养液底部有气体逸出，待停止放气时，再加入氨基磺酸铵，使NO₂^-完全转化为N₂而逸去，取培养液于白瓷比色板上，加Griess试剂3-5滴，培养液无色，最后再取培养液于比色板上，滴加3-5滴二苯胺，培养液呈现蓝色。

所述硝化细菌的培养是将硝化细菌培养于硝化细菌培养液中以15-30℃、150-160r/min培养10-15天，打散菌胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中，同时使硝化细菌数量增大；待培养后将扩大数量的硝化细菌于硝化细菌固体培养基中，以15℃、160转/min培养20-25天；即得到培养有硝化细菌的培养液。所述硝化细菌培养液为1.0g NaNO₂、1.0g Na₂CO₃、0.25gNaH₂PO₄、1.0g CaCO₃、0.75g K₂HPO₄、0.01g MnSO₄、0.03g MgSO₄·4H₂O、1000mL蒸馏水、pH7.2；所述硝化细菌固体培养基是在硝化细菌培养液中加入硝化细菌培养液总重量5-10％的琼脂。所述滴加盐酸后加入20-30粒氨基磺酸铵；反应停止放气时，再加入1粒氨基磺酸铵，每粒0.00065g。

本发明所采用的培养液中NO₂^-去除方法，具有如下优点：

1、采用本发明方法去除培养液中NO₂^-可大大提高反应体系中NO₂^-的反应速率和转化率。

2、本发明方法可用于定性鉴定不同菌株的硝化能力，并且可应用于环境中硝化细菌生长状态的检测，同时还可指导废水处理中投加硝化细菌的时间控制。