[发明专利]使用摇瓶发酵法制备大秃马勃液体发酵培养基的方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用摇瓶发酵法制备大秃马勃液体发酵培养基的方法。

背景技术

大秃马勃又称大马勃、马勃、马屁包，是一种食药用真菌，具有相当的经济价值。子实体大型，近球形至球形，直径15～36cm，或更大，无不孕基部或很小，由粗菌索与地面相连，包被白色，后变污白色，同腊状外包被和较厚的内包被组成，初期微具绒毛，渐变光滑，脆，成熟后开裂成块脱落，露出浅青和褐色的孢体。夏秋季生于旷野的草地上，单生至群生，在新疆山地草原及内蒙古呼盟草原可形成“蘑菇圈”。分布于我国河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林、江苏、西藏、甘肃、云南、青海、宁夏、新疆等地区。幼时可食用，味鲜可口。成熟后可药用。具有消肿，止血、清肺润喉和解毒作用。目前人工栽培未能成功，但可利用菌丝体深层发酵培养。因此此次实验，对于研究和利用马勃及食药用真菌都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用摇瓶发酵法制备大秃马勃液体发酵培养基的方法，根据该方法制备得到的培养基，。

本发明提供食药用菌液体发酵培养基采用的技术方案是：

使用摇瓶发酵法制备大秃马勃液体发酵培养基的方法，培养时间为1-4天，温度为20℃-28℃，初始pH为5.0-6.0。

优选的，培养时间为2天。

优选的，培养温度为22℃。通常真菌的最适生长温度为28℃，本发明结果表明大秃马勃在此温度下生长却最差，这与其本身的特性有关。大秃马勃属于蕈菌类真菌，本身在自然界生长繁殖的最佳温度就是在20℃-25℃之间，本发明中当温度从20℃升高到28℃，菌丝体的产量经历了一个先增加再减少，而峰值出现在22℃。因此温度选在22℃。

优选的，初始pH为5.5。通过影响细胞内pH值来影响细胞内酶的活性及一些微量元素，如镁离子、铁离子、钙离子与锌离子等的溶解性。还可以影响细胞膜透性，在酸性条件下，细胞质膜被氢离子饱和，限制了阳离子的通行；在碱性条件下，细胞质膜被氢氧根离子饱和，限制了阴离子的通行。

本发明的有益效果是：

1)本发明通过控制初始pH、发酵时间及温度得到大秃马勃菌液体发酵培养基，经本发明制得的培养基可在较短时间内获得大量菌丝体及其发酵产物；

2)本发明周期短、产量高、成本低、工艺设备简单。

附图说明

图1是温度对菌丝生物量的影响；

图2是发酵时间对菌丝生物量的影响；

图3是pH对菌丝生物量的影响。

具体实施方式

使用摇瓶发酵法制备大秃马勃液体发酵培养基的方法，培养时间为1-4天，温度为20-28℃，初始pH为5.0-6.0。

优选的，培养时间为2天，培养温度为22℃，初始pH为5.5。

菌种活化培养基——PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

配制方法：称取去皮马铃薯200g，切块后加水煮沸，30min后两层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，加水至1000ml，煮沸，分装，121℃高温湿热灭菌30min。取出冷却备用。

摇瓶发酵培养基——PDA液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

在超净工作台上，取活化后的大秃马勃斜面培养物一支，首先往试管里加入10ml水，用灭菌竹签轻轻刮落斜面表面的菌体(要注意刮时的力量大小，不能把培养基刮脱)，然后把菌液加入50ml装有小玻璃珠的三角瓶中，摇动三角瓶2min，使孢子分撒均匀，得到大秃马勃的孢子悬液，测得该孢子悬液的浓度为3.65×107个/ml。

灭菌：所有培养基均采用高压蒸汽灭菌121.3℃，20min。

接种：每瓶液体培养基无菌操作接入3.65×107个/ml的孢子悬液1ml。

培养：根据顾林峰同学得出的最佳转速及第一次实验得到的最佳培养温度22℃作为基本培养条件，在此基础上结合实验项目(培养时间，初始pH值)恰当组合进行摇床培养。

本次实验采用目测，每天观察菌丝体在各培养基中生长的快慢，并记录。

发酵结束后，发酵液过滤收集菌丝体，蒸馏水洗涤3次，于3000rpm离心10min，60℃烘干至恒重，用电子天平称量干重。

取1ml液体培养基于培养皿中，在培养皿下面放一张黑白相间的格子纸，然后进行计数，重复3次。随机取液体培养基中15个菌丝球，在培养皿中排成一列，测其总长度，求平均值，每一处理重复3次。