[发明专利]锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白2及其单克隆抗体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及青蟹养殖生物技术领域，尤其涉及锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白2及其单克隆抗体和应用。

背景技术

锯缘青蟹(Scylla serrata，学名为Mud crab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。

病毒病是锯缘青蟹养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失，因此锯缘青蟹养殖过程中，对各类病毒病的研究是当前的重要课题。

2004年始在珠海发现患“嗜睡病”(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒：锯缘青蟹双顺反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)和呼肠孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。

MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80％以上，因此对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养殖需要解决的重要问题。

双顺反子病毒(dicistrivirus)是一个新分类的病毒属，随着海洋病毒学的不断深入，越来越多的水生生物的双顺反子病毒被发现，但是其结构蛋白还未见研究，有关锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)的结构蛋白的研究也未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种锯缘青蟹双顺反子病毒的结构蛋白2。

本发明的另一个目的在于提供上述锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白2的单克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒或胶体金试纸中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

本发明人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV，电镜观察发现其直径为20～30nm，球形，无囊膜，呈二十面体对称，在CsCl中的浮力密度为1.32～1.36g/cm³，核酸性质分析发现此病毒基因组为单股正链RNA病毒ssRNA(+)。

本发明人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两个开放读码框ORF1和ORF2，其中，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码结构蛋白。

本发明人对ORF2进行进一步地研究发现，ORF2由三个结构蛋白组成，分别是分子量为53KD的结构蛋白1(简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3(简称VP3)。

接着，本发明人对结构蛋白2进行了一系列的研究分析，如下所示：

1、氨基酸序列及其编码核苷酸序列

结构蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

编码结构蛋白2的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

2、单克隆抗体的获得

本发明人首先采用全病毒(MCDV)作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方法从阳性单克隆抗体中将结构蛋白2的单克隆抗体筛选出来，最终获得能识别MCDV结构蛋白2的单克隆抗体。

3、结构蛋白2的定位

本发明人在MCDV病毒分离纯化的基础上，对其三个结构蛋白的N端氨基酸进行了测序，并与MCDV的基因组序列对比和结构分析，在MCDV基因组中找到了三个结构蛋白的相应位置。

为了进一步对结构蛋白2精确定位，本发明人采用免疫电镜方法，观察上述Western blot结果中，结构蛋白2的单克隆抗体所识别的抗原决定簇的位置，电镜结果显示，该抗原决定簇定位于病毒粒子的边缘，从而实现了对MCDV结构蛋白2的精确定位。

本发明筛选到的MCDV结构蛋白2的单克隆抗体可用于MCDV的感染机制和致病性研究，用于青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，用于锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)活体的中和作用，以及用于制备体外检测样品中是否存在MCDV病毒的试剂盒或胶体金试纸条。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白2的氨基酸序列、核苷酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白2进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向；

2.本发明筛选到结构蛋白2的单克隆抗体可用于MCDV监控和检测的多个方面。

附图说明

图1为实施例1中纯化MCDV的SDS-PAGE电泳图；