[发明专利]海水中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及海水中病毒的浓缩方法，具体涉及到海水中病毒的浓缩方法和甲肝病毒(Hepatitis A viruses，HAV)浓缩方法的回收率测定。

背景技术

海水中的病毒数量少，而病毒粒子太小又不能用物理方法捕集，它们的浓缩依赖于病毒与滤器的静电和疏水相互作用。国外最常用的滤器是吸附-洗脱微孔滤器，一般称之为VIRADEL。VIRADEL迫使水流过一个滤器，静电和疏水两种作用使病毒吸附到滤器上。滤器有两种常见类型：负电性的和正电性的。最常用的电负性滤器是Filterite，要使用带负电性的滤器，必须要事先加入阳离子盐，以使pH降低，减少净负电荷，有利于病毒最大吸附，但是pH调节有些繁琐。正电性滤器表面净正电荷可增强对电负性病毒的吸附，这些滤器不需多价盐就能在很宽的pH范围内有效地吸附病毒，正电性滤器可以由含正电性有机聚合树脂的玻璃纤维或纤维素组成。Hiroyuki建立了一套改进的带负电荷的膜，用其进行海水中的病毒浓缩，发现在浓缩海水中病毒方面优于常用的带正电荷的膜，病毒回收率高，干扰物质少，而且只需采集2L的海水即可。许多学者尝试了多种方法从海水中浓缩病毒，但是迄今为止，仍未有一种公认的、简便的、回收率高的、可操作性强的检测技术和装置。

发明内容

本发明提供一种海水中病毒的浓缩方法，该方法包括：取水样10L用双层纱布过滤水样至玻璃缸中；用1mol/L HCl将10L海水样品的pH调至3.5；加入终浓度为0.0005mol/L的AlCl₃，混匀；静置30min后，用净水器通过蠕动泵抽滤；海水全部滤过后，用pH为10.4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗脱；洗脱液置于透析袋中用PEG-6000透析；在4℃条件下，将洗脱液浓缩至2mL左右，立即检测或-20℃冻存。

本发明还提供利用上述方法进行的海水的预处理。

本发明还提供一种海水中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括：

(1)制备阳性对照和阴性对照：用添加病毒减毒活疫苗的海水作为阳性对照，未添加病毒减毒活疫苗的灭菌海水作为阴性对照；

(2)用上述浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的海水和未添加病毒减毒活疫苗的海水进行浓缩，得到浓缩样品；

(3)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp；

(4)HAV标准曲线的建立：用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作10²～10⁷6个梯度的稀释；

20μL RT-PCR反应体系为：10.0μL的SYBR Premix Ex Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX Reference Dye II(50×)、质粒模板2.0μL和灭菌水6.8μL；

反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环，熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(5)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算海水样品中病毒的回收率。

在上述方法中，病毒的实例为甲型肝炎病毒。

附图说明

图1是HAV实时定量RT-PCR标准曲线图；

图2是HAV实时定量RT-PCR扩增曲线图；

图3是HAV实时定量RT-PCR熔解曲线图。

具体实施方式

(一)海水中病毒的浓缩方法：

1、取水样10L用双层纱布过滤水样至玻璃缸中；

2、用1mol/L HCl将10L海水样品的pH调至3.5；

3、加入终浓度为0.0005mol/L的AlCl₃，混匀；

4、静置30min后，用净水滤器抽滤；

5、海水全部滤过后，用pH为10.4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗脱；

6、洗脱液置于透析袋中用PEG-6000透析；

7、在4℃条件下，将洗脱液浓缩至2mL左右，立即检测或-20℃冻存。

(二)回收率的测定：

用荧光实时定量RT-PCR方法计数(以甲型肝炎病毒的计数为实施例)。

1、样品的制备：取2mL的甲型肝炎减毒活疫苗添加到10L海水中，作为试验样品，用甲型肝炎减毒活疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加甲型肝炎减毒活疫苗的10L海水作为阴性对照；