[发明专利]海产贝类中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法

权利要求书

1.一种海产贝类中病毒的浓缩方法，该方法包括：

取25g贝肉组织于匀浆器中快速匀浆，将匀浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体积的甘氨酸缓冲液(pH9.0)；调整pH至7.2±0.4，室温条件下震荡30min左右，4℃条件下，5,000×g离心15min，取上清液；上清液于4℃条件下，10,000×g离心1h，再次收集上清液；上清液在超速离心机中140,000×g离心1.5h，弃上清；沉淀用1mL PBS(pH7.4)重悬，以溶解沉淀；将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然后4,000×g离心30min；吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500μL浓缩样品，冻存备检。

2.海产贝类中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括：

(1)取2mL的病毒减毒活疫苗添加到25g匀浆的贝肉中，作为试验样品，用病毒减毒活疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加病毒减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；

(2)用权利要求1所述的浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的贝肉和未添加病毒减毒活疫苗的贝肉进行浓缩，得到浓缩样品；

(3)采用Trizol的方法进行贝类体内病毒RNA的提取；

(4)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V₁-V₃衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp；

(5)病毒标准曲线的建立，用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作10²～10⁷6个梯度的稀释；

20μL RT-PCR反应体系为：10.0μL的SYBR Premix Ex Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX Reference Dye II(50×)、质粒模板2.0μL和灭菌水6.8μL；

反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环，熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(6)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算贝类样品中病毒的回收率。

3.根据权利要求2所述的病毒浓缩回收率的测定方法，其中病毒为甲型肝炎病毒。