[发明专利]一种来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有启动子活性的核苷酸片段及其应用。

背景技术

棒杆菌属于革兰氏阳性菌。一些棒杆菌作为工业微生物在生物工程领域里广泛 应用，可以用来生产多种化学物质，例如氨基酸和核苷酸，L-谷氨酸、L-赖氨酸、 L-苏氨酸、L-色氨酸、肌苷酸等。氨基酸和核苷酸可用作药品、食品、食品添加剂、 动物饲料。经过物理和/或化学方法诱变处理得到的棒杆菌突变株具有较强的合成 上述有用物质的能力，而通过遗传工程和/或代谢工程对棒杆菌野生菌株或突变株 进行改造，可以获得具有更高生产强度的菌株。这种遗传工程的基本操作即是在棒 杆菌中表达涉及多种代谢途径的基因。通常基因都是在启动子控制下表达，其表达 强度依赖于启动子元件。已经在棒杆菌基因组、棒杆菌带有的质粒以及棒杆菌噬菌 体中分离出33个具有启动子活性的核苷酸片段，这些核苷酸片段中包括一些已知 基因的启动子例如，amt、argS、fda、gap基因等((Pátek M et al.，Journal of Biotechnology 104：311-323，2003)。来自大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌的 启动子能够在棒杆菌属细菌中表达，说明棒杆菌中的mRNA聚合酶既可以识别来自 革兰氏阳性细菌，又可以识别来自革兰氏阴性细菌中的多种启动子(Martín J F et al.， Nature Biotechnology 5(2)：137-146，1987)。大肠杆菌trp操纵子的 operator-repressor系统在谷氨酸棒杆菌中仍然有功能，并可以被吲哚乙酸(IAA) 所诱导。Tsuchya等利用大肠杆菌的lac和λ噬菌体P_RP_L operator-repressor系 统，在棒杆菌中表达了氯霉素乙酰转移酶(TsuchiyaM & Morinaga Y，Nature Biotechnology 6(4)：428-430，1988)。Liebl等使用tac启动子和lacI构建 了可诱导的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体，大量表达了金黄色葡萄球菌的 核酸酶(Liebl W et al.，Journal of Bacteriology 174(6)：1854-1861，1992)。 已知trc启动子可以在棒杆菌属细菌中显示活性(Patek M et al.，Journal of Biotechnology 104：311-323，2003)。在谷氨酸棒杆菌中构建的表达系统大都使 用了大肠杆菌中的强启动子，例如Ptrp、PlacUV5、Ptac等。

但是，由于大肠杆菌的启动子在棒杆菌中有泄漏阻遏，以及有关诱导物在较低 浓度下不易穿过棒杆菌的细胞壁等原因，因而在实际生产中其应用还很有限。仍然 需要从谷氨酸棒杆菌中筛选可受各种物理化学因子诱导的严谨的启动子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种启动子。

本发明提供的启动子是从谷氨酸棒杆菌基因组分离得到的核苷酸片段并且具 有启动子活性。本发明中的术语“启动子”系指DNA上一段序列，RNA聚合酶结合 到该序列上，可以起始基因的转录。

所述启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；

3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸 序列。

所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷 酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交 液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次 30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

本发明的启动子活性片段还包括与来自SEQ ID NO.1的片段的核苷酸序列互补 的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。