[发明专利]表皮干细胞诱导驯化为脂肪细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导细胞的方法，具体地说是利用表皮肝细胞诱导驯化为脂肪细胞的方法。

背景技术

人类对表皮干细胞的研究，已有几十年历史，但由于其难以诱导分化一直被认为是单能干细胞，即仅能分化成为表皮的相关成分。再生医学在医学领域中炙手可热，干细胞的研究在再生医学领域中已占据了重要的低位，干细胞由于其具有多分化潜能，在特定的条件下可以分化为各种组织器官的能力得到科学家们的关注。胚胎干细胞是一种全能干细胞，其能分化为除胎盘外的所有组织和器官。但由于胚胎干细胞的研究涉及伦理学的诸多问题，所以本领域技术人员一直致力于寻找另外一种全能干细胞来替代胚胎干细胞。

人们把目标逐渐锁定在成体干细胞上。目前，本领域技术人员已经成功的将MSC(间充质干细胞)，ADSC(脂肪干细胞)等成体干细胞诱导分化为其他类型的细胞，如软骨细胞、骨细胞、心肌细胞等。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因此，目前将MSC作为一种骨组织工程的种子细胞与支架材料可修复损伤的组织在临床已普遍应用。间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。但是利用MSC诱导分化功能细胞的弊端为：MSC的来源有限，取材又很麻烦，从取材上比较受局限；MSC诱导培养周期长，培养过程复杂，不易培养和扩增，因此MSC的应用遇到很多阻碍。

表皮干细胞又称专一性干细胞或单能细胞，是指只能产生一种细胞类型，但具有自更新属性的细胞。本领域技术人员一直将表皮干细胞归为单能细胞。对于表皮干细胞的应用范围也受单能细胞的影响而受限。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种将具有多潜能的成体干细胞通过定向驯化诱导分化为脂肪细胞的方法。为以后临床组织工程的应用提供一种潜在的种子细胞，.可以广泛应用在创伤修复、基因治疗、美容等方面，为人类提供方便。

为了达到上述目的，本发明的思路为：在对表皮干细胞的深入研究中，我们了解到表皮的附件毛囊、汗腺都存在多向分化潜能的干细胞，并且与表皮毗邻的真皮也存在这样的干细胞，难道作为机体含量最丰富的干细胞，就是仅仅只能分化表皮细胞的单能干细胞吗？带着这个疑问，我们开始对表皮干细胞多能性进行了漫长的研究。

在研究过程中，我们充分认识了表皮干细胞的相关特性，也了解到表皮干细胞在eplife培养系统问世之前是一种非常难以培养的干细胞，它必须培养在低钙离子浓度或无钙离子的培养系统中才能维持其干性减少向表皮分化。Eplife培养系统不仅为其提供了这样的环境还加入了许多生长因子更加有利于表皮干细胞的干性的维持，且在我们的实验过程中也发现在原代培养后可以使表皮干细胞的干性上升。但这种生长特点又给诱导分化带来了难题，诱导分化的目的细胞需要一定浓度的钙离子存在，这是其发育所必须的。

因此怎样保持表皮干细胞的干性相对稳定和积极引导其向目的细胞分化成为本发明需解决的首要问题。由于eplife培养系统对表皮干细胞干性的维持具有明确的意义(已被实验证实)，因此我们选择了像调制鸡尾酒一样的方法将eplife培养基与诱导培养基进行不同比例的混合，使表皮干细胞有充足的时间适应eplife培养基不断减少诱导培养基逐渐增加，并有利于减少向表皮分化增加向目的细胞转变的机率。我们将这种培养过程称之为驯化。

本发明所采用的具体的技术方案为：

一种表皮干细胞诱导驯化为脂肪细胞的方法，该方法的具体步骤是：

(1)将表皮干细胞经培养后，取稳定生长的密度为80％～95％的表皮干细胞，PBS洗细胞两遍，更换新鲜Eplife培养基，20～30h后更换为脂肪诱导培养基和干性维持培养基的混合培养基中培养3～5天，脂肪诱导培养基和干性维持培养基的浓度比为1∶3～5；

(2)将脂肪诱导培养基和干性维持培养基的浓度比更换为2∶3～5继续培养4～8大；

(3)完全更换为脂肪诱导培养基无干性维持培养基，并以脂肪诱导培养基诱导其分化至少10～20天以上。

上述的表皮干细胞诱导驯化为脂肪细胞的方法，所述的脂肪诱导培养基成分及用量为：