[发明专利]核酸酶P1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于制备核酸酶P1的方法，具体而言，本发明涉及从麦芽根中提取核酸酶P1的方法。

背景技术

核酸酶P1(5’-磷酸二酯酶)是一种重要的特种酶制剂，其主要应用于两个领域，一是分子生物学领域，在该领域中要求使用高纯度的核酸酶P1，其在国内外很多试剂公司都能买到；另一个重要领域就是医药核苷酸及食品呈味核苷酸的生产，即将核酸降解为5’-核苷酸。一方面，5’-核苷酸具有调节机体机能的功效，可作为医药的辅助添加剂使用；另一方面，在呈味食品的生产中，核酸酶P1水解核酸产生的5’-核苷酸是食物鲜味的主要成分，特别是鸟苷一磷酸(GMP)和肌苷一磷酸(IMP)可以显著增加食品的鲜味。目前，全球仅有阿玛诺天野特种酶制剂一家公司可以生产食品级核酸酶P1，并且该公司生产的核酸酶P1价格昂贵。

从目前已有文献来看，核酸酶P1主要通过两种方式生产：一是利用微生物发酵生产，这种方式工艺复杂，产品容易被霉菌孢子污染；二是从啤酒大麦芽生产的副产物麦芽根中提取，但从麦芽根中提取的粗酶液中除了核酸酶P1(5’-磷酸二酯酶)以外，还含有磷酸单酯酶及3’-磷酸二酯酶，因而在实际应用中造成产物杂质较多的缺陷。

现有技术中，从麦芽根提取核酸酶P1的工艺路线基本一致，通常为：以新鲜麦芽根为原料，经过粉碎过筛、浸提、压滤除渣、以及离心分离等步骤获得核酸酶P1。虽然目前已有多篇文献报道了对核酸酶P1提取工艺参数(例如，筛目大小、浸提温度、pH值等)的优化选择，但目前所能获得的核酸酶P 1的酶活最高只能达到474U/ml(麦芽根中5’-磷酸二酯酶的制备及性质，华东理工大学学报，2002，8)。在将通过现有技术获得的核酸酶P1用于生产呈味核苷酸时，酵母抽提物中呈味核苷酸的含量最高仅为16000mg/kg，这导致在呈味核苷酸实际生产过程中核酸酶P1的用量较大，通常在30-50％(体积浓度)以上，很难被生产企业所接受。

因此，需要对现有技术中从麦芽根提取核酸酶P1的方法进行改进，找到一种制备核酸酶P1的新方法，以生产出活性显著提高的核酸酶P1。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于制备核酸酶P1的方法，具体而言，提供一种从麦芽根中提取核酸酶P1的方法。通过本发明方法所获得的核酸酶，与现有技术相比，酶活性显著提高，因而能够用于高效生产呈味核苷酸。

根据本发明用于制备核酸酶P1的方法，包括以下步骤：(1)将麦芽根粉碎过筛，向过筛后的麦芽根粉末中添加水，并在混匀后加入无机盐，将pH值调至5.5-6.0，在33-37℃下搅拌提取8-16小时；(2)对上述提取液进行压滤以除去大颗粒滤渣，收集滤过液；(3)离心所述滤过液，收集上清液，以得到核酸酶P1提取液。

根据本发明用于制备核酸酶P1的方法，在一种实施方式中，向麦芽根水溶液中同时加入MgSO₄和ZnSO₄两种无机盐，并且MgSO₄和ZnSO₄的添加浓度分别为4-10g/L和1-3g/L。

根据本发明用于制备核酸酶P1的方法，在一种实施方式中，在离心收集上清液后还包括以下步骤：(4)使上清液经0.5微米膜除去大分子杂质，收集透过液；(5)使透过液经截留分子量为5-10KD的膜进行超滤浓缩，收集截留液，得到浓缩的核酸酶P1提取液。

根据上述制备核酸酶P1的方法，其中，所使用的膜为有机卷式膜。

根据本发明用于制备核酸酶P1的方法，在一种实施方式中，在经膜浓缩后还包括：(6)向截留液中加入1-6g/L的ZnSO₄，在30-45℃、真空度-0.08～-0.12MPa条件下进行浓缩，以得到高度浓缩的核酸酶P1提取液。

根据本发明用于制备核酸酶P1的方法，在一种实施方式中，还包括：(7)将高度浓缩的核酸酶P1提取液在60-70℃条件下处理10-15分钟，以灭除核酸酶P1提取液中的杂酶。