[发明专利]一种精氨酸脱亚胺酶及其重组表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物活性蛋白质及其交联物的药理学领域，特别涉及一种为优化与聚乙二醇交联而重组表达的精氨酸脱亚胺酶及其应用。

背景技术

精氨酸是一种营养物质，在细胞分裂过程中起着重要的作用，但对人体而言却是非必需氨基酸，正常细胞在氮的存在下能够依靠精氨酰琥珀酸合成酶通过瓜氨酸合成精氨酸。然而，有些癌细胞因缺乏精氨酰琥珀酸合成酶的基因，而不能自身合成精氨酸，只能依靠外来的精氨酸细胞才能生存。也就是说，精氨酸对有些癌细胞而言是必需氨基酸。因此，凡能分解耗尽外源性精氨酸的酶，例如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)，就能使癌细胞因精氨酸的供给被阻断而死亡。

有抗癌作用的精氨酸脱亚胺酶可从支原体等多种微生物中分离得到，它能在细胞内将精氨酸分解成瓜氨酸和氨。在大肠杆菌中表达有抗癌活性的支原体精氨酸脱亚胺酶早有报告，并发现支原体精氨酸脱亚胺酶的活性比其它来源的精氨酸脱亚胺酶更强，目前研究得最透彻的支原体精氨酸脱亚胺酶来源于精氨酸型支原体，在培养细胞和动物体内可有效地抑制癌细胞的生长(参阅H.Takaku，In vivo antitumor activity of arginine deiminase purified frommycoplasma arginini，Int.J.Cancer 51(1992)244-249)。

作为一种治疗药物，精氨酸脱亚胺酶本身就具有一般蛋白质药物的不足，即：稳定性不好，在体内很快被分解排出，其血清半衰期只有五小时。但精氨酸脱亚胺酶只有在血清中保持相当长时间的活性才能抑制癌细胞的生长起到治疗作用。此外，精氨酸脱氨酶也是一种外源性蛋白质，能诱发人体内的免疫反应，使酶失去活性或对机体造成免疫损伤。聚乙二醇可与蛋白质的赖氨酸发生共价交联，精氨酸脱亚胺酶与聚乙二醇交联后则有助于解决这些问题。目前有多家公司生产可与蛋白质交联的活性聚乙二醇。已有中国专利报告，与聚乙二醇交联可延长精氨酸脱亚胺酶的血清半衰期(参阅中国专利申请号：98805066.8公开号：CN1255944，被修饰的精氨酸脱亚胺酶)。与聚乙二醇交联的人型支原体精氨酸脱亚胺酶已进入治疗肝细胞癌和恶性黑色素瘤的临床试验，并有少数病例的治疗研究报告发表。(参阅F.Izzo，PEGylated arginine deiminase treatment of patients with unresectablehepatocellulaar carcinoma，J.Clin.Oncol.22(2004)，1815-1822)。

尽管应用与聚乙二醇交联的精氨酸脱亚胺酶治疗某些癌症的研究已有进展，但是目前所用的精氨酸脱亚胺酶，包括人型精氨酸脱亚胺酶(Mycoplasma hominus)，精氨酸型精氨酸脱亚胺酶(Mycoplasma arginini)和关节炎型精氨酸脱亚胺酶(Mycoplasma arthrititis)均来源于支原体等微生物。它与聚乙二醇交联的赖氨酸位点是天然决定的，呈不合理分布，靠近催化中心的赖氨酸与聚乙二醇交联后降低了酶的活性，因此只有重新安排与聚乙二醇交联的赖基酸的位点，使其相对均匀地分布在精氨酸脱氨酶的表面，并避免聚乙二醇交联在酶活性部位或其附近，这样才能使聚乙二醇交联的精氨酸脱亚胺酶的活性提高，发挥最佳的治疗效果，同时随着聚乙二醇交联率的提高，酶的稳定性也得到了提高，也进一步减少了酶蛋白的异源性。目前尚未见到通过基因重组的方法全面优化精氨酸脱亚胺酶上的赖氨酸位点来提高其与聚乙二醇交联效果的报告。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种优化的精氨酸脱亚胺酶(ruADI)。

本发明的另一目的在于提供上述精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法。

本发明的另一目的在于提供一种包含了上述精氨酸脱亚胺酶的交联物，该交联物由精氨酸脱亚胺酶和活化聚乙二醇交联而成。

本发明的再一目的在于提供上述交联物应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：所述精氨酸脱亚胺酶的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

所述精氨酸脱亚胺酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

上述精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，包括以下步骤：

(1)设计合成了精氨酸脱亚胺酶的13个DNA模板：

DNA模板1：