[发明专利]对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列

说明书

本申请是以下发明专利申请的分案申请：

申请日：2008年3月6日

申请号：200810026651.2

发明名称：对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列

技术领域

本专利涉及对流感病毒有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定

背景技术

流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之 一。据历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。 如今，美国每年有2万人死于流感，俄罗斯每年也有1万人死于流感，英国每年 有5万人由流感发展成肺炎，其中约20％死亡。据估计，全球每年流感患者死 亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、 癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大“杀手”。

流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenza virus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲乙丙不仅反映了病毒被发现的年代及前 后顺序，更主要的是反映了对人类危害程度的顺序。甲型变动常以流行形式出现， 引起世界性流感大流行，在动物中分布广泛，并也能在动物引起流感流行和造成 大量动物死亡。

尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保 护约70～80％的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新 的潜在爆发的毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和 其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40％。 由于大部分的死亡都是发生在高风险人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不 能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流感药物也能够降低流感感染的发生 和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的承受能力、可能出现的 抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流感病毒感染 的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感 的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途 径是医学研究的重大课题。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是1998年首先在线虫发现的由双链 RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默机制。RNAi一经发现，迅速成为生 物学研究领域中最为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科 学成就之一，2002年又将其列为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为 2002年度最重要的科技发现之一；Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因RNA干 扰的发现而获得了2006年诺贝尔生理医学奖。随着广泛深入的实验研究的进行， 人们对RNAi的机制有了更多的了解。

目前认为RNAi的主要过程为：①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细 胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA的结构特征是5′端单磷酸，3′端羟基，而且3′端有2～3-nt 的碱基突出；②RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex，RISC) 的形成阶段。siRNA与RNAi特异性酶(如Ago-2)结合，形成RISC，具有特 异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA；③效应阶段。 RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物 上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶 目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5′端10-nt)，从而阻断了其 翻译成蛋白质，表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同， 它们与靶mRNA 3′非编码区(untranslated region，UTR)通过不完全互补结合， 抑制翻译过程和蛋白质的合成。

RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对 简单，周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择、 siRNA的制备和基因导入方法

作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物 细胞也存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾 病和遗传性疾病的治疗研究。