[发明专利]一种用于检测牛流产鹦鹉热衣原体抗体的试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌检测试剂盒及制备方法，确切讲是一种检测牛流产鹦鹉热原体抗体的ELISA试剂盒。

背景技术

衣原体(Chlamydia)广泛分布于世界各地，可以引起动物和人的多种疾病，特别是鹦鹉热嗜性衣原体[Chlamydophila(Cp)psittaci]和流产嗜性衣原体(Cp.abortus)，可由动物传染给人，导致严重的人兽共患性疫病(zoonotic infections)发生。

牛衣原体病中对养牛业危害最严重的是牛衣原体性流产，该病是由衣原体感染牛引起的一种地方流行性的接触性传染病，以妊娠母牛流产、早产、死产或产无活力犊牛为主要特征。该病的同义名有牛流行性流产、牛地方流行性流产、牛新立克次体性流产。早在二十世纪二十年代，美国人首先报道了牛地方流行性流产综合征；到1956年，德国人采用血清学实验和细胞培养技术，证明原联邦德国奶牛流行性流产是由衣原体感染所致。以后欧洲许多国家，加拿大、前苏联、日本、印度也相继报道牛衣原体性流产。牛衣原体性流产虽然是一种地方流行性疫病，但分布广泛，在流行区内本病主要侵害处女母牛、头胎母牛或从非疫区引进的母牛，流产率高达25％-75％。

目前，诊断家畜衣原体病的血清学方法主要有补体结合试验、正向间接血凝试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法。这些方法所使用的抗原多为衣原体全菌体，由于动毒培养抗原，就存在散毒、感染人的危险存在。另外，补体结合试验操作复杂，不易推广；间接血凝试验虽然操作简单，但敏感性较差参见：1.Markey BK，et al.Comparison of serological testsfor the diagnosis of Chlamydia psittaci infection of sheep.Vet Microbiol.1993，36(3-4)：233-52.；2.Qiu C，et al.Seroprevalence of Chlamydia infection in buffaloes in China.Indian Journal of AnimalSciences，2001，71(1)：27.；3.邱昌庆，才学鹏.动物疫病基因工程疫苗研究与进展.北京：中国农业出版社，2005.；4.农业部：农业行业标准：动物衣原体病诊断技术(NY/T 562-2002)。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术的不足，可供家畜用的衣原体病快速、准确的诊断试剂及检测方法，以及这种检测试剂的制备方法。

本发明的用于检测牛流产鹦鹉热衣原体抗体的ELISA试剂盒中有

a.横向包被的流产鹦鹉热衣原体、纵向包被有作为二抗的兔抗牛IgG-HRP的酶标板；

b.洗涤液；；

c.封闭液；

d.底物缓冲液A和底物缓冲液B；

e.终止液，

其中包被的流产鹦鹉热衣原体抗原为流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白Omp A，特别是流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白OmpA的重组蛋白。

本发明的用于检测牛流产鹦鹉热衣原体抗体的试剂盒中Omp A抗原的最佳包被浓度为1∶320，血清的最佳稀释倍数为1∶40，酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000。

本发明所述的任一用于检测牛流产鹦鹉热衣原体抗体的试剂盒的制备方法中Omp A抗原的一般包被条件下OD₄₅₀值在2.5-4.5之间，其最佳包被条件是：1∶320倍稀释的重组蛋白加反应板的小孔内在37℃包被1小时，然后在4℃过夜继续包被，在此条件下所得到的OD₄₅₀值为4.83。

本发明所述的任一试剂盒中所用的重组流产嗜性衣原体外膜蛋白Omp A的制备方法是以从流产嗜性衣原体提取细菌的总DNA为模板，设计两对特异性引物进行套式聚合酶链反应。由于本发明是从组织中提取基因组，组织培养时衣原体所占得比例很小，采用套式PCR的方法可以提高它的敏感性。

扩增得到流产嗜性衣原体外膜蛋白A的完整基因(ompA)，将该基因克隆到原核表达载体中，获得重组表达载体；用重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；将此重组质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达得到疫苗用抗原蛋白。

本发明的制备方法中，制备重组流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白Omp A所用的两对引物分别是：

第一对引物的上游引物为P1  5’-GAG GTGAGTATGAAAAAACTC TTG-3’，