[发明专利]阿德福韦酯耐药变异检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体阿德福韦酯耐药变异遗传的试剂盒，通过检测阿德福韦酯用药靶向位点基因多态性来评估个体阿德福韦酯物耐药性。

背景技术

阿德福韦酯是阿德福韦的亲脂性口服前体，其肠道吸收率和生物利用度都较高，口服后在非特异性酯酶水解作用下迅速转化为阿德福韦。阿德福韦是一种无环单磷酸脱氧腺苷类似物，在体内进一步转化为有活性的双磷酸阿德福韦而起抗病毒作用。实验研究和临床试验都证明阿德福韦酯可迅速降低乙肝病毒DNA的浓度，减轻肝脏组织的病变。

长期使用阿德福韦酯可诱导乙肝病毒变异，并产生耐药性，使血清中已经转阴的乙肝病毒DNA重新出现，甚至伴有病情复发。

目前已知的阿德福韦酯耐药主要原因为rtN236T位点变异。rtN236T变异则是由P基因第836位碱基A到C点突变引起，即发生了碱基间氢键的变化。

发明内容

本发明提供一种检测个体阿德福韦酯耐药变异遗传的试剂盒。

该试剂盒包括：检测阿德福韦酯耐药变异位点P基因rtN236T位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，反应缓冲液，去离子水。

本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例  检测试剂盒的使用

步骤1：DNA模板的抽取

用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。

步骤2：荧光定量PCR反应

使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mMMgCl₂溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。

在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。

步骤4：基因型分析

根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。

熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。