[发明专利]同时检测多基因DNA甲基化的方法及其应用

权利要求书

1.一种同时检测多基因甲基化水平的方法，包括下列步骤：

1)用亚硫酸盐法处理待检测的DNA，使其含有的所有的未甲基化的胞嘧啶都转变为尿嘧啶；

2)将多种待测DNA的连接探针在同一个反应体系里与经第1)步处理后的DNA混合后，先进行DNA变性反应，再进行DNA与探针的杂交反应，而后在DNA连接酶的作用下发生连接反应；

3)以步骤2)获得的连接产物为模板，使用通用引物进行PCR扩增，其中通用引物中的反向引物5’端均标记了生物素；

4)将步骤3)获得的PCR扩增产物与交联了各种反条码杂交探针的荧光编码微球混合，先高温变性后退火杂交，然后加入亲和素-藻红蛋白(SA-PE)孵育，最后使用Luminex100或Luminex 200等液态芯片平台进行读取分析。

2.如权利要求1所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述DNA连接酶为耐热的DNA连接酶。

3.如权利要求1所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述连接探针包括上游探针和下游探针，上游探针从5’到3’分别为上游通用引物序列、地址序列和基因特异序列，下游探针从5’到3’分别为基因特异性序列和下游通用引物序列。

4.如权利要求3所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，对于不同的待测DNA序列，其连接探针中的地址序列各不相同。

5.如权利要求3所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所有待测DNA的连接探针中的上游通用引物序列均相同，所有待测基因连接探针中的下游通用引物序列也相同。

6.如权利要求3所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述上游探针中的基因特异序列与下游探针中的基因特异性序列都与待测DNA的同一条链互补，下游探针的基因特异性序列紧接着上游探针的基因特异序列与模板链互补配对结合，上下游探针序列的基因特异性序列与模板链互补配对的中间无间隙；上游探针的基因特异序列中必须含有一个或以上的CG序列，并且3’末端为CG。

7.如权利要求6所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，下游探针的基因特异序列中也含有一个或以上的CG序列。

8.如权利要求6所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述上下游探针的基因特异序列部分的Tm值在50-70℃范围内。

9.如权利要求3所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述下游探针的5’端经磷酸化修饰。

10.如权利要求1所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述步骤3)中，通用引物中的反向引物5’端标记了生物素。

11.如权利要求1所述同时检测多基因甲基化水平的方法，其特征在于，所述反条码杂交探针为与前述待测DNA的连接探针上的地址序列互补的探针，且一种荧光编码微球仅与一种待测DNA的反条码杂交探针交联，不同的荧光编码微球与不同的待测DNA的反条码杂交探针交联。

12.一种同时检测多个基因的DNA甲基化的试剂盒，包括各待测基因的连接探针和通用引物，还包括待测基因的反条码杂交探针或分别交联了待测基因的反条码杂交探针的荧光编码微球。

13.如权利要求12所述同时检测多个基因的DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括p16^INK4a、RASSF1A、MGMT、DAPK、RARβ、GSTP1、APC基因的连接探针和通用引物，还包括p16^INK4a、APC，DAPK、RARβ、RASSF1A、MGMT、GSTP1基因的反条码杂交探针或分别交联了p16^INK4a、APC，DAPK、RARβ、RASSF1A、MGMT、GSTP1基因的反条码杂交探针的荧光编码微球。