[发明专利]条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性测定方法，特别是涉及条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性的测定方法。

背景技术

光动力疗法是近20年来建立和发展起来的一种新型肿瘤疗法。其原理主要通过光敏剂富集于病灶处，并在光照下产生光敏损伤来实现对肿瘤细胞的杀伤作用。光动力治疗在很大程度上取决于采用的光敏剂的性质。

传统光敏剂具有严重的皮肤光毒性等缺点，开发新型光敏剂成为研究热点。藻胆蛋白是很好的纯天然色素，可用于食物、化妆品、荧光检测等领域，近年来，根据其吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻红蛋白、藻蓝蛋白均可作为光敏剂。国内首先有蔡心涵、何立明等报道100μg/mL螺旋藻藻蓝蛋白经铜泵激光器辐照12J/cm²，使人大肠癌细胞HR8348存活率仅为22.2％。之后又有李冠武、王广策等报道用提取自多管藻的藻红蛋白处理人口腔8113细胞和小鼠S180细胞，再经488nm氩离子激光器辐照25J/cm²，发现细胞存活率分别为25％和24％。藻胆蛋白以其高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂。

相比螺旋藻、多管藻，条斑紫菜在我国已大量人工栽培，具有量上的优势，其本身作为高等红藻也富含藻胆蛋白。建立条斑紫菜藻胆蛋白抑瘤活性的测定模型，有利于为新型抑瘤光敏剂的开发应用提供技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性的测定方法：以条斑紫菜为原料，通过对小鼠B-16肉瘤的抑制作用研究，测定紫菜藻胆蛋白的抑瘤活性；为紫菜藻胆蛋白在抑瘤方面的应用，提供研究模型；为藻胆蛋白在抑瘤领域提供更为丰富廉价且有效的原料；为新型光敏剂开发应用提供技术方案。本方法以INNOVR 400氩离子激光器为光源时，对肉瘤杀伤率更高。

本发明的目的是这样实现的：

一种条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法，包括如下步骤：

(1)培养小鼠B-16黑色素瘤细胞；

(2)待细胞生长旺盛时，用胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞于离心管中冰浴，在小鼠左前肢肋下皮下接种；

(3)饲养7-10天后，挑选移植瘤直径长至0.5-0.7cm的小鼠实验；

(4)将小鼠于瘤边缘0.5cm处皮下注射高纯度蛋白溶液，4h后给予激光辐照，辐照后的小鼠避光饲养，连续观察10天并记录瘤重；

(5)计算抑瘤率，测定抑瘤活性。

所述的细胞培养液为10％小牛血清的1640培养液；所述的细胞培养条件为37℃、5％CO₂浓度及饱和湿度；所述的激光辐照能量为100-200J/cm²。

由于本发明以条斑紫菜藻胆蛋白和小鼠B-16黑色素瘤细胞为材料，通过激光辐照杀伤肿瘤细胞，因此，具有以下优点：

1、藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然晾干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg 30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；

2、藻胆蛋白提取方便，根据之前制备流程(发明专利申请号：2004100990370)，目前从条斑紫菜提取高纯度藻胆蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高；

3、黑色素瘤细胞一般见于皮肤表层，便于光动力治疗；

4、黑色素瘤发病率逐年增高，光动力治疗肿瘤副作用小，该方法一旦应用于临床，市场前景广阔；

5、从结果看，条斑紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白均对癌细胞有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。

附图说明

图1：R-PE对小鼠B16黑色素实体瘤生长的抑制作用。

图2：C-PC对小鼠B16黑色素实体瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

以下将结合实施例，对条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法，作进一步详细的描述。条斑紫菜(采自江苏吕泗条斑紫菜栽培海区)；小鼠(昆明鼠，购自复旦大学动物房)；小鼠B-16肉瘤细胞(购自中科院细胞库)；其它试剂均为以化学分析纯按常规配制。

实施例一：

本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻红蛋白(R-PE，紫菜藻红蛋白)和小鼠B-16肉瘤，具体步骤如下：