[发明专利]人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程和抗病毒药物制备技术领域，特别涉及一种人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及其制备方法和应用。 

背景技术

病毒感染性疾病严重危害人类健康，研制高效、特异性抗病毒药物具有重要的现实意义。 

防御素是人们在研究哺乳动物、昆虫等防御和抵抗病原微生物侵袭及感染的过程中发现的一种分子量为3-6kD的内源性阳离子肽。之所以被称为阳离子肽，是因为成熟的防御素分子内富含精氨酸(一种碱性氨基酸)，因而在多数情况下防御素分子都带有较强的正电荷。人们对防御素的最初认识是基于其快速、强效的杀菌活性，但后来研究发现，除了抗菌活性外，大部分防御素还具有抗真菌、抗螺旋体以及抗病毒的作用。尤其是一些防御素对严重影响人类健康的病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤状病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等显示出一定的杀伤和抑制作用。研究资料表明，防御素分子可以通过阻碍病毒颗粒粘附和侵入哺乳动物细胞以及抑制病毒DNA转录等个环节发挥抗病毒作用。由于防御素是一种内源性分子，本身具有识别病原微生物与机体正常细胞的能力，所以在有效剂量范围内不会对人体正常细胞造成明显影响，也不会诱发产生耐药现象。正因如此，防御素的研制与开发在病原微生物感染防治方面具有广阔的应用前景。 

人α-防御素5(HD5)主要由肠道上皮细胞和生殖道粘膜上皮细胞分泌表达。由于生殖道粘膜是HIV、HPV和HSV-2等病毒在人体内的主要传播部位，因此，理论上讲HD5应具有更明显的抗此类病毒活性。Buck等在进行α防御素抗HPV研究时发现，与其它已知的人类防御素分子相比，HD-5的抗病毒活性最为突出 (Buck CB et al，PNAS，2006，103：1516-1521)。但是，无论哪一种防御素，其抗病毒作用都不如抗菌效果显著，研究表明α防御素抗病毒时的半数有效浓度(IC50)一般要比抗菌时的IC50高数倍以上(Tanabe Hetal，J Virol，2004，78：11622-11631)。这就意味着当应用防御素多肽进行抗病毒治疗时其用量要显著增加，如此不仅会加重病人的经济负担，更重要的是会超出人体正常细胞对其的耐受力，引发毒副反应。此外，包括HD5在内的大多数防御素多肽在血清存在的情况下，其抗病毒活性会受到显著抑制，从而使得防御素的体内应用受到很大限制。 

已知，防御素的抗菌及抗病毒活性不仅与其自身所特有的双极性有关，而且还与整个分子及分子内部重要位置氨基酸残基所带正电荷的多少有关。有研究证实，当将防御素分子内带正电荷的精氨酸(碱性氨基酸)替换为中性氨基酸或酸性氨基酸时，防御素的抗菌和抗病毒活性会显著下降。反之，如果将防御素分子内某一或某些酸性氨基酸突变为碱性氨基酸时，突变后的防御素分子的抗菌和抗病毒活性有可能得到显著提高(Higgs Retal，Immunogenetics，2007，59：573-580)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及制备方法和应用。根据改变防御素分子内氨基酸残基组成和所带电荷量可影响其生物学功能的特性，在HD5自身具有一定抗HSV、HPV和HIV等病毒作用的基础上，通过重要位置氨基酸定点突变和抗病毒活性筛选，获得抗病毒活性显著增强的HD5突变体多肽。本发明的HD5突变体多肽在有无血清存在的情况下均具有高效的抗病毒活性，其抗病毒作用较母本HD5多肽显著提高。本发明的HD5突变体多肽可以用于防治HSV、HPV及HIV等病毒的感染。 

本发明的技术方案是： 

人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽的氨基酸序列如下： 

Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser 

1                5                  10                  15 

Leu Ser Gly Val Cys Arg Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys 

            20                  25                  30 

Cys  Arg 

在天然HD5的第21位谷氨酸(Glu，E)被替换为精氨酸(Arg，R)。 

编码权人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽的DNA序列，其序列如下：