[发明专利]具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种能促血小板生成的 具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

血小板在机体生命活动中发挥着重要作用，血小板减少可引起出血、感染， 甚至危及生命。随着社会的发展，血小板减少症患者越来越多见，资料表明， 绝大多数血小板减少症的发生都是由于血小板生成障碍所致。血小板的前体是 巨核细胞，其生成过程遵循造血干细胞典型的阶段式分化模式：骨髓造血干细 胞-早期髓系共同祖细胞-巨核/红系祖细胞-巨核祖细胞-巨核细胞-血小 板。可见，巨核细胞增殖分化在血小板的生成过程中发挥着重要角色。

研究表明，血小板生成素(TPO)是巨核细胞增殖分化和血小板生成过程中最 重要的调控因子，它又称为巨核细胞生长与发育因子(MGDF)。体内外实验证实， TPO通过结合并激活其受体-c-Mpl而发挥促进巨核细胞增殖分化和血小板生成 的作用。c-Mpl是I型细胞因子受体超家族的一员，主要表达于巨核系各分化阶 段的细胞。然而，由于一种通过基因工程制备并经聚乙二醇化的功能型TPO在临 床试用过程中有诱导产生中和性TPO抗体的现象，因此，至今美国FDA都未批准 重组人TPO进入临床。在这种情况下，人们不得不寻找并研发新一代的升血小板 药物。

TPO模拟肽(TMP)是一种与天然TPO完全不同源但生物活性却十分相似的短 肽，总共只有14个氨基酸残基组成(Cwirla SE et al，Science，1997，276： 1696-1699)。体外实验证实，该短肽与TPO受体-c-Mpl有着很高的亲和力，并能 够刺激TPO细胞依赖株(Ba/F3/c-Mpl)增殖与分化。研究表明，当两个c-Mpl形 成同源二聚体时才能有效激活其下游信号通路。因此，与单个TPO模拟肽相比， 两个串联TPO模拟肽的促血小板生成活性更突出(Cwirla SE et al，Science， 1997，276：1696-1699)。但由于TPO模拟肽分子量非常小，无论是单个还是两 个串联的TPO模拟肽在体内的代谢排除都很快，因而使其在体内的应用受到限 制。

生长激素(GH)是一种具有广泛生理功能的生长调节因子，由于它可以有效 动员并刺激造血干和多系造血祖细胞(包括巨核系祖细胞)的增殖与分化，目前 国内外的一些单位已经尝试将重组人生长激素(rhGH)用于治疗肿瘤化/放疗所 引起的全血细胞减少(Sirohi B et al，Bone Marrow Transplant，2007， 39：115-120)。已知，生长激素生物学功能的发挥主要是通过其受体-GHR介导完 成，而且GHR也是I型细胞因子受体超家族的一员。GHR与TPO受体c-Mpl所激活的 信号通路一样，都需要有蛋白激酶JAK2的参与和反馈调节。因此，GHR与c-Mpl 信号通路之间可能会存在着一定的交叉对话和相互调节作用。

已经授权的发明专利ZL200510057217.7，我们将单个TPO模拟肽与人生长 激素分子进行融合，通过基因工程方法制备出重组融合蛋白rTMP-GH。由于TPO 模拟肽可以识别并结合巨核细胞表面的TPO受体c-Mpl，因此，在该融合蛋白中 单个TPO模拟肽主要是发挥靶向引导人生长激素分子至巨核细胞的作用。由于 单个TPO模拟肽只能结合一个c-Mpl，所以不能有效激活其受体信号通路，使得 rTMP-GH融合蛋白主要通过人生长激素分子发挥升血小板作用，其生物利用低， 作为药剂时用量大、毒副作用较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种能促血小板生成的具有高效升血小板作用的融合 蛋白及其制备方法，该融合蛋白由两个串联的TPO模拟肽和一个人生长激素分 子构成，能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作为药剂时用量小、 毒副作用小。本发明可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且所述融合蛋白升 血小板的效果更显著。

本发明的技术方案是：

具有高效升血小板作用的融合蛋白，由两个串联的TPO模拟肽和一个人生 长激素分子组成。其中，两个TPO模拟肽的氨基酸序列相同，均由14个氨基酸 组成(序列表SEQ ID NO：1)；人生长激素分子则是由191个氨基酸组成(序列 表SEQ ID NO：2)。