[发明专利]用于核酸PCR产物直接测序的测序引物和测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序领域，尤其涉及一种用于核酸PCR产物直接测 序的测序引物和测序方法。

背景技术

PCR产物测序大多采用传统克隆测序技术，包括：1)PCR产物与质 粒载体连接；2)连接产物转化细菌；3)细菌培养；4)模板制备等繁 琐步骤，操作麻烦且耗时长。

PCR产物也可以采用直接测序的方法进行测序，目前最常用的PCR 产物直接测序方法仍是Sanger双脱氧核苷酸介导的链终止法，与普通 的PCR反应相比，由于链终止法的测序反应依赖于由单向引物与模板特 异结合后引发的线性扩增，因而对测序模板和引物要求非常严格。该方 法中影响PCR产物直接测序成败的关键因素包括：1)测序模板的质量； 2)测序引物的特异性和扩增效率。模板的质量可以通过PCR产物切胶 回收纯化、SAP-Exon I纯化、乙醇/醋酸钠纯化等多种方法加以控制， 从而得到高质量的特异性模板。然而，由于PCR产物的多样性，使得测 序引物的设计和选择一直是困扰PCR产物直接测序的一个问题。并非所 有的PCR扩增良好的引物都能用于测序反应，如简并引物、随机引物、 过长的引物(大于24bp)、自身易形成二级结构的引物、纯度不高的引 物等等，如果简单地将常规的PCR引物直接用于测序常常会导致测序结 果不理想或测序反应失败。另需要根据不同的PCR产物重新设计测序引 物，但会造成测序周期的延长和成本的增加。

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供用于核酸PCR产物直 接测序的测序引物，所述测序引物适用范围广。

本发明的另一个目的在于提供高效、稳定、快捷的用于核酸PCR产 物直接测序的测序方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，所述测序引物的碱基序列 如SEQ ID NO：1和2所示。

用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，包括以下步骤：

1)根据待检测的目标核酸序列设计并合成一对扩增引物，所述扩 增引物包括根据目标核酸序列设计的特异性引物序列和位于特异性引 物5’端的测序引物序列，合成一对测序引物；

2)采用所述扩增引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物；

3)纯化所述PCR扩增产物，得到纯化的测序反应模板；

4)用纯化的测序反应模板，以所述测序引物进行测序反应，得到 测序反应产物；

5)纯化所述测序反应产物；

6)对纯化的测序反应产物进行序列测定。

所述测序引物的碱基序列如SEQ ID NO：1和2所示。

所述步骤3)具体为：PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切下 待测目标核苷酸目标扩增片段，经凝胶纯化试剂盒纯化，得到纯化的测 序反应模板。

本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，经GenBank中 BLAST比对结果显示该通用引物序列不与数据库中已知的常见致病性微 生物、人类及其他哺乳类生物常见基因核酸序列具有完全同源性，不会 引起非特异的测序反应，测序结果可以特异性地反映出序列的真实碱基 组成，所以进行病原微生物快速筛查和鉴定、遗传性疾病的分子诊断和 单核苷酸多态性研究，都可以利用本申请所述测序引物。

本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，不需将待测PCR 产物插入质粒载体，而直接对PCR产物进行核酸序列测定。与传统克隆 测序技术相比，省去为测序而反复进行的分子克隆、细菌培养和模板制 备等繁琐步骤，具有快速、简便、经济，并能更好地反映模板的真实情 况的优点，因而可被广泛地应用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单 核苷酸多态性分析、病原微生物快速检测和鉴定等领域。

附图说明

图1是HBoV阳性标本PCR扩增产物电泳图，图中M为DNA标准带， 3、6为HBoV阳性标本，10为阴性对照，1、2、4、5、7、8、9为HBoV 阴性标本。

图2A和2B是人类博卡病毒PCR阳性产物测序图。

图3是四种腹泻病毒阳性标本PCR扩增产物电泳图，图中M为DNA 标准带，1、2为RV阳性标本，3、4为NV阳性标本，5、6为EAV阳性 标本，7为As tV阳性标本，8为阳性对照，9为阴性对照。

图4是四种病毒PCR阳性产物测序图。

具体实施方式