[发明专利]一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用

说明书

一、技术领域

本发明属于基因人工改造和生物防治技术领域，具体涉及一种人工设计的Bt抗虫基因， 及其在鳞翅目害虫防治上的应用。

二、背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体蛋白可作为生物农药特异地毒杀某些昆虫。该晶体蛋白被 昆虫摄取后，在昆虫肠道的碱性条件下溶解产生130KD左右的前毒素分子，经肠道蛋白酶 水解前毒素的C端被降解，最后产生由N端65-70KD组成的毒蛋白。该毒蛋白的N端一 段残基(就Cry1A而言为28个)进一步被肠蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白。 活化的毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，插入到中肠细胞膜上形成0.5～1.0 nm的小空或离子通道，引起胞内离子的外渗及水的内渗，造成细胞溶胀破裂，大量细胞遭 到破坏，致使幼虫停止进食而死亡。

研究证明，Bt晶体蛋白对人体、哺乳动物、鸟类、鱼类以及很多有益昆虫均无毒害作 用，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面应 用了近50年。但由于自然条件下Bt晶体蛋白稳定性差，杀虫效果受天气影响大，易被太 阳照射降解，也不能渗透到植物组织内部，易被雨水冲刷掉；且其必须被昆虫取食到才能发 挥杀虫功能，这些限制因素使该生物杀虫剂的发展一直受到很大制约，所以目前对农业害虫 的防治还主要依靠化学杀虫剂。

20世纪80年代中期，随着植物基因工程技术的成熟、Bt基因克隆的成功及对Bt晶体 蛋白杀虫剂机制研究的深入，使人们有可能将Bt基因转入植物获得可表达杀虫蛋白的抗虫 转基因植物。目前，全世界已有26种以上Bt转基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要 农作物。

野生型Bt晶体蛋白基因在转基因植物中的表达量非常低。在CaMV 355启动子驱动下 其表达量约占总可溶性蛋白的0.001％左右，不能使转基因植物获得毒杀多数对Bt毒蛋白 不太敏感的昆虫。并且来源于Bt的杀虫基因直接转入植物中还存在表达产物不稳定的问题。 1991年，Perlark等(FREDERICK J.PERLAK等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324 -3328，1991)根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物mRNA稳定性的基序在保持 原Bt基因编码的氨基酸序列不变前提下，对Bt晶体蛋白基因Cry1 Ab和Cry1 Ac进行了 改造。改造的基因在转基因烟草和番茄中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分别提高 了约10倍和100倍。然而，这种改造只是部分使用了偏好密码子，大部分氨基酸仍使用了 多个密码子(表3FM Cry1Ab基因)。

同时，不同植物的密码子使用频率存在差异，以同是高等植物的单子叶植物和双子叶植 物为例，单子叶植物氨基酸密码子简并位(末位)偏向使用C或G，而双子叶植物部分氨基 酸密码子的简并位却偏向使用A或U(Wilbur H.Campbell等Plant Physiol.199092，1-11)。 因此，根据植物密码子的使用频率设计基因，在不同作物中表达量也会存在差异，要想在特 定作物中高量表达目的基因，应根据本作物的偏好密码子来改造目的基因。

水稻是我国乃至世界的最重要粮食作物之一，每年由于大螟、二化螟、三化螟、稻纵卷 叶螟等鳞翅目害虫危害，损失惨重。目前水稻田间生产，如果不使用化学农药防治鳞翅目害 虫，可使产量损失达60％左右。近年来，由于水稻基因组计划的完成，大大方便了水稻基因 序列和密码子信息的获得，使得分析水稻密码子使用频率成为可能。如能根据水稻的密码子 使用频率，挑选偏好密码子改造现有的BT毒蛋白基因，使其在水稻中稳定高效表达，无疑 具有重要意义。

三、发明内容

发明目的

转基因技术可打破生殖隔离，实现不同物种间的基因转移。但是在一个物种高效表达的 基因，被转化到另一物种后，表达量不一定高，也不一定还能具有本来的功能，特别是对于 差异较大的物种。物种密码子偏好性是影响外源基因表达量的诸多因素之一。不同的物种往 往具有不同的偏好密码子。分析这种偏好性，在转基因之前，对需要转化的目的基因进行密 码子的重新设计或改造，将对提高外源基因在受体生物中的表达量具有重要作用。

Cry1Ab蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒害作用的伴胞晶体。 Cry1Ab基因在生物防治领域具有重要的应用前景。但是Cry1Ab基因来源于细菌(苏云金 芽孢杆菌)，直接应用到转基因植物中，表达量低，抗虫性效果差。