[发明专利]用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物

说明书

技术领域

本发明涉及一套检测毒株的引物，尤其涉及一套用于可视化检测猪瘟病 毒野毒株的RT-LAMP引物，属于猪瘟病毒毒株的检测领域。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的 一种以高热和出血为主要特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重大传 染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列入须申报OIE疾病名录。CSFV属于 黄病毒科瘟病毒属，其基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有单一 的开放阅读框架(ORF)，编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，经 蛋白酶裂解为4种结构蛋白(衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白E^rns、E1、E2)以及8种 非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS 3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中NS5B基 因序列是可靠的CSFV基因型分类依据。

与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)也 可以感染猪，与CSFV存在血清学交叉反应，给猪瘟诊断带来很大困难(孙世 琪，靳野，郭慧琛，等.我国近期猪瘟分子流行病学动态.动物医学进展， 2004，25(6)：69-71；Paton DJ，Greiser-Wilke I.·Classical swine  fever--an update.Res Vet Sci，2003，75(3)：169-178.)。另外，由于 猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我国的大规模应用，使得CSFV野毒感染猪和疫 苗接种猪的鉴别变得困难。目前猪瘟诊断方法有很多，包括病毒分离培养、 动物接种试验、血清学诊断方法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等。其中病 毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不 足；常规的血清学试验又都存在一定的血清学交叉反应，难以将CSFV与同属 的BVDV和BDV感染区分开，也很难鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种，而实时荧 光定量PCR方法对实验仪器的要求很高。虽然单克隆抗体技术用于诊断在一 定程度上弥补了这一缺陷，但是基于抗原抗体反应的检测技术仍有一定的局 限性(如敏感性不够高)，如胶体金检测技术。上述方法或多或少存在缺 陷，不适合于基层实验室及现地的快速准确检测。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术。该技术 特异性强、灵敏度高、成本低廉，特别适合在现场和基层部门应用。由于反 应产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色 混浊物。目前，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊 度仪，可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。此外还可以向产物中加入 荧光染料的方法进行判定。自从LAMP方法问世以来，已经应用于胚胎性别鉴 定和不同病原体的检测。

文献报道表明，LAMP方法已经成功用于人、畜禽和水生动物的多种病原 体的检测。如犬瘟热病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒等都已应用该技术建立 了相应的检测方法。关于CSFV的RT-LAMP方法也有报道(陈蕾，范学政，王 琴，等.猪瘟病毒RT-LAMP快速诊断方法的建立.动物传染病与兽医公共卫 生，2008，209-213；Chen HT，Zhang J，Ma LN，et al.Rapid pre-clinical  detection of classical swine fever by reverse transcription loop-mediated  isothermal amplification[J].Mol Cell Probes，2009，23(2)：71-74.)，但均不能用 于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一套可视化检 测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，由一对外围引物 和一对内引物组成；其中，一对外围引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ  ID NO：2所示，一对内引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所 示。