[发明专利]益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性、定量测定方法

权利要求书

1.一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的定性测 定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、模板DNA的制备

（1）取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500.0μL TE缓冲 液，混合均匀，再置于液氮中进行完全冻结，冻结后取出放入65℃水浴中 进行融化4-6min，如此反复进行冻融3-5次；

（2）冻融结束后，往其中加入60.0μL以质量体积比计10%SDS和 10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动 4h；

（3）加入100.0μL5M NaCl和100.0μL10%CTAB/NaCl溶液，65℃ 水浴10min；所述CTAB/NaCl溶液是将4.1gNaCl溶于80ml水中，再缓慢 加入10g CTAB得到的溶液；

（4）加入与在步骤（3）得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混 合物，它们的体积比分别是25：24：1，混匀，再以10000g离心10min， 该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；

（5）吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异 戊醇混合物抽提一次，分离上清液；

（6）往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积 的冰异丙醇，混合均匀，再静置30min，以10000g离心5min，得到总DNA 沉淀；

（7）所述沉淀用体积比70%乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然 干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下 保存备用;

B、PCR扩增

反应体系25.0μL：2.5μL10×PCR Buffer、1.0μL25mmo1/L Mg²⁺、2.0μL 2.5mmol/L dNTPs、2.5μL5mmol/L上下游引物、1.0μL50ng/μLDNA模板， 0.25μL5U/μL Taq酶，ddH₂O补足至25.0μL；

上下游引物分别是：

上游引物REf为5’-GATTGACGATGGATCACCAG-3’；

下游引物REr为5’-ACTACCAGGGTATCTAATCC-3’，扩增片断长 度为740bp；

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性40S，56℃退火30S，72℃ 延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃ 下保存；

取3.0μLPCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测;

C、结果及判断

检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以 灭菌水作为模板为阴性对照；根据在740bp处出现预期特征条带，确定该 益生菌乳制品中含有罗伊氏乳杆菌，相反地则不含有罗伊氏乳杆菌。