[发明专利]用于定量检测EGFR突变的试剂盒

说明书

发明背景

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是HER/ErbB家族成员之一，与肿瘤增殖、血管生成、肿瘤转移和抗细胞凋亡有关。

大多数肿瘤细胞表达EGFR及其天然配体，结合后可引起自身的磷酸化，通过一系列反应将信号传递到核内，从而通过影响肿瘤细胞的生长凋亡，肿瘤血管生成，来影响肿瘤的发展与演进。

有研究表明EGFR在癌症启动和进展阶段发挥重要作用。针对EGFR的靶向治疗药物，如阿瓦斯丁(AVASTIN)、特罗凯(Erlotinib)，吉非替尼(Irressa)等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能通过阻断肿瘤细胞EGFR信号传导，来抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。

但是临床实践显示仅有8-18％的非小细胞肺癌患者可以受益于易瑞沙等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Paez JG，et al，Science，2004，304：1497-1500；Sequist LV，et al，Oncologist，2007，12(1)：90-8)。目前发现，携带EGFR基因突变的病人疗效显著，突变的频率与易瑞沙相对敏感的人群相一致：女性多于男性；非吸烟者多于吸烟者；腺癌多于其他；东方人多于西方人。通过对易瑞沙相对敏感患者组织EGFR基因的突变分析，发现大多数个体在EGFR基因酪氨酸激酶区域发生突变。这些突变主要集中在外显子18-21上(Chan SK，et al，Eur J Cancer，2006，42(1)：17-23)。因此，通过EGFR基因18-21号外显子的突变检测可以很好预测易瑞沙等分子靶向药物的治疗效果。本发明主要考虑中国人EGFR基因突变的热点位点(韩宇等，中华肿瘤学杂志，2007，29(4)：278-282；郭健等，中国肺癌杂志，2007，10(6)：504-507)，通过实时定量PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因EGFR第18、19、21外显子5种类型的突变情况，通过本发明EGFR基因突变检测来预测易瑞沙等分子靶向药物的治疗效果。

本发明采用的检测方法具有以下几个优点：操作简单，易于标准化。其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1％，而直接测序法敏感度20-50％。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型；定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲线，精确测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种EGFR基因突变的定量检测试剂盒。定量检测EGFR基因第18外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)2155位G碱基置换为A碱基；第19外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3)2235-2249位碱基缺失；第19外显子2236-2250位碱基缺失；第19外显子2254-2277位碱基缺失；第21外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4)2573位T碱基置换为G碱基的突变情况。

为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液及可特异性扩增EGFR基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法：

(1)分别在EGFR基因第18、19、21外显子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与EGFR特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。

(2)为精确定量所测EGFR突变比例，本发明设计了标准品。

(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。

(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的EGFR基因突变占总体EGFR基因的比例。

所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。