[发明专利]铜绿假单胞菌抗原

说明书

技术领域

本申请涉及来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗原蛋白以及这些蛋白在药物中的应用，尤其是在铜绿假单胞菌感染的治疗、预防和诊断中的应用。

背景技术

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性需氧能运动细菌。它是一种在环境中普遍存在的、细胞外、机会性病原体，能使免疫受损患者产生明显的发病率和死亡率。感染对于囊性纤维化、烧伤、慢性支气管炎、支气管扩张和癌症患者特别显著。

最近已经对铜绿假单胞菌基因组进行了测序，项目细节放在因特网上(http://www.pseudomonas.com)。然而，在本发明的优先权日，该信息不完全，且没有证实。现在这个信息完全了并已经被证实。

免疫反应的鉴定、对候选疫苗和用于诊断检测的合适成分的寻求集中于铜绿假单胞菌的外膜成分。铜绿假单胞菌的外膜包含毒素，包括脂多糖内毒素、磷脂和外膜蛋白(OMPs)。

多种铜绿假单胞菌外膜蛋白(OMPs)已经指定了字母命名体系。虽然用这个方案描述了几个蛋白的特性，但是其中一些蛋白的表达只是短暂的且高度依赖于营养可利用性、培养条件和抗生素的存在。目前，认识到三个主要的OMPs，称为F、H2和I，是铜绿假单胞菌所有菌株的共有抗原，且以高拷贝数量表达。

发明内容

发明人采用蛋白纯化方法分离OMPs和胞质蛋白的均一制品。采用Zwittergent提取及修改的液相柱层析和凝胶电泳步骤，已经纯化了几个蛋白，鉴定并估计了它们的疫苗潜力。用它们的分子量来表示这些蛋白，其本质经氨基末端测序而确认。

发明人已经分离和鉴定了来自铜绿假单胞菌标本的蛋白。这些蛋白称为Pa13、Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80。已经得到了Pa13、Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80的氨基末端序列。序列分析后，用BLAST(基本本地比对检索工具，国立生物技术信息中心，Bethesda，MD，美国，Altschul等，Nucleic Acids Research，25 3389-3402(1997))，对获得的数据进行检索。Pa20归于ACP，因为它与来自丁香假单胞菌和铜绿假单胞菌的蛋白具有同源性。Pa40与已知的铜绿假单胞菌脂肪族酰胺酶具有同源性。检索没有发现称为Pa13、Pa45和Pa80的蛋白。

因此，本发明的第一个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约13kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列：

A E T I V N T T K A

Ala Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NO：1)。

本发明的第二个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约45kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列：

M R A E L N Q G L I D F L K A

Met Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO：2)。

本发明的第三个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约80kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列：

M S E Q N N E Q R S Q A A(SEQ ID NO：3)

Met Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala。

本领域熟练技术人员会领会到本发明的蛋白或多肽的同系物或衍生物也可用于本发明文本中的用途，即作为抗原/免疫原性物质。因此，例如包括一个或更多添加、缺失、替代等的蛋白或多肽包括在本发明中。另外，也可能用相似“类型”的另一个氨基酸置换一个氨基酸。例如用另一个疏水氨基酸置换一个疏水氨基酸。可以使用程序如CLUSTAL程序比较氨基酸序列。这个程序对氨基酸序列进行比较并通过在任一序列中适当插入空格找到最佳比对。对于最佳比对，计算氨基酸等同性或相似性(氨基酸类型的等同性加保守性)是可能的。象BLASTx等程序会排列最长区段的相似序列并赋予该匹配一个值。这样就可能得到比较，其中发现类似的几个区域，每个具有一个不同的分值。本发明中考虑到分析的两种类型。