[发明专利]卷烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟烟气的毒性检测分析，尤其是一种卷烟烟气遗传毒性的体 外细胞微核检测方法，可应用于评价卷烟烟气的遗传毒性。

背景技术

微核试验作为推断化合物染色体损伤的遗传毒性检测方法，具有快速、简 便、经济等特点，在环境化合物快速筛选和大量职业暴露人群检测方面得到广 泛应用(曹佳，林真，余争平.微核试验——原理、方法及其在人群监测和毒性 评价中的应用[M].军事医学出版社，北京，2000)。微核检测的敏感性、特异 性和准确性优于其它染色体畸变分析，因此许多国家和国际组织将其规定为新 药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理学安全性评价的必需实验(杨颖.体外 微核技术及其进展.国外医学卫生学分册[J]2007，34(2)：80-83)。自20世 纪70年代，各国都在不断研究微核检测新方法，各种新技术、新手段层出不穷。 目前，微核检测方法主要集中于镜检法(常规微核试验、胞质分裂阻滞法、荧 光原位杂交试验与DNA探针、抗着丝粒抗体染色)和自动化法(图像分析系统 检测和流式细胞仪检测)。

但微核检测的每种方法都存在其不足之处：镜检法费时费力，且存在主观 误差；图像分析系统检测存在部分微核不能被识别，产生假阴性结果；以往流 式细胞仪检测微核易受凋亡小体释放细胞核颗粒的影响，产生假阳性结果。同 时，在大规模药物筛选和环境化合物遗传毒性检测方面，现有的微核检测方法 较难满足当前需求。

CORESTA(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco)烟草烟气体外毒性测试工作组建议以L5178Y小鼠淋巴瘤细胞为染毒 对象，通过荧光显微镜方法检测细胞微核率。该方法存在诸多不足：染毒细胞 凋亡，出现凋亡小体，干扰微核镜下观察，导致假阳性；微核镜下计数1000多 个细胞，工作量大；人为因素可能影响微核镜计数结果。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术的不足，而提供了一种可以快速、准确、 高通量的微核检测新方法——一种卷烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方 法，该方法采用EMA和SYTOX对细胞核进行染色，进而区分微核、凋亡小体及 细胞核。通过流式细胞仪，结合体外细胞培养试验，应用RNase酶和荧光探针 排除干扰，可满足微核检测的高通量需求。同时本方法能够检测细胞内DNA分 布。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的卷烟烟气遗传毒性 的体外细胞微核检测方法，以永生化人支气管上皮细胞为靶细胞，进行染毒处 理，细胞经低渗、高渗等处理，并经两种荧光探针染色，流式细胞仪分析。具 体步骤包括：指数生长期细胞，烟气冷凝物染毒处理，收集细胞进行处理，经 EMA探针染色，洗涤后，低渗溶液膨胀细胞，并对细胞膜打孔处理，RNase A水 解RNA，SYTOX与DNA结合，加入高渗溶液，破碎细胞膜，释放细胞核，SYTOX 与DNA结合。梯度离心(2500×g，15min)后，进行流式细胞仪分析。

在本发明中，细胞处理过程如下：取5×10⁵个细胞于15ml聚丙烯离心管中， 离心，弃上清，轻打重悬细胞。加入300μl EMA染液，浸入碎冰，可见光源 照射细胞悬浮液，持续30min。光激活结束后，加入3ml 2％胎牛血清液，以 锡箔纸包裹管子避光。上述溶液离心，弃上清，轻打重悬细胞；于室温下，慢 速加入500μl裂解液I，迅速涡旋，室温放置1h；用力打入500μl裂解 液II，涡旋，室温放置30min后，离心后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后， 流式细胞仪检测。

所用的裂解液I溶液包括以下组分：每毫升溶液中含有氯化钠0.1-1mg， 柠檬酸钠1-10mg，IGEPAL 0.1-1μl，RNase A 0.05-0.5mg，SYTOX 0.25 -1μmol，以去离子水配制。

所用的裂解液II溶液包括以下组分：每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2 mg，柠檬酸15-25mg，SYTOX 0.25-1μmol，以去离子水配制。

本发明的原理如下：