[发明专利]一种以壳聚糖为载体的固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以壳聚糖为载体的固定化方法，特别是用于酶、细胞、菌体、发酵液或蛋白质的固定化方法。

背景技术

固定化是相对于游离酶或细胞而言的。通过化学或物理的手段使目标物质束缚在载体区域中，同时又保持了催化活性并且可以反复利用。固定化后，酶或细胞随着载体的移动而移动，因而在科研和生产中人们可以通过操作肉眼可见的固体状的载体而控制不可见的酶和细胞的行为。

固定化的方法主要有吸附法、包埋法和交联法。决定固定化工艺是否具有实际经济价值的关键性因素是载体的价格和性能。海藻酸钠、卡拉胶和壳聚糖是研究最多的载体，来源丰富，价格便宜，然而应用到工业化的例子却不多。这些物质用于固定化的共同程序是制胶、造粒和硬化，其中造粒和硬化可以同时进行。对于固定化的工业应用，颗粒的形状不是衡量的指标，更加重要的是比表面积、机械强度和过滤性能。上述常规技术还存在一些缺陷。第一个缺陷是造粒技术往往是挤出成型，非常难以实现大规模操作，且颗粒大小极难控制。第二个缺陷是通过上述常规工艺形成的颗粒机械性能差，难以耐受持续的机械搅拌，其弥补方法是装成酶柱，然而这样又极大地限制了它的应用范围，要求反应液必须有一定的流动性能才能应用。第三个缺陷是常规的发酵液固定化手段必须先收菌得到菌体，而许多微生物发酵液过滤困难，采用大规模离心手段收集菌体并非工业化首选，因此工业上不得不采取陶瓷膜等其他手段代替固定化。

以壳聚糖为固定化载体的报道较多。例如，王俊等(王俊等，《化工进展》，2004，23(10)，1117-1120)报道了“以壳聚糖为载体固定化海藻糖合成酶”；赵江等(赵江等，《郑州工程学院学报》，2004，25(2)，34-37)报道了“胃蛋白酶固定化条件的研究”；蔡俊等(《生物技术》，2003，13(5)：11-12)报道了谷胱苷肽硫转移酶(GST)的固定化及酶学特性研究；任广智等(《离子交换与吸附》，2000，16(4))报道了磁性壳聚糖微球用于脲激酶的固定化研究。上述方法都是将壳聚糖先造粒，经过处理后再与目标产物交联或吸附固定，其中也包括将壳聚糖包裹到磁性颗粒表面的做法，但这种做法难以放大，且成本更高，吸附量更小。上述方法都存在固定化颗粒交联度不均一，强度不均一的缺点。上述方法应用于发酵液固定化时，都需要将发酵液进行固液分离、收集菌体后再进行固定化操作，固液分离的效果对设备的依赖性较高。

本申请发明人将壳聚糖的絮凝作用与固定化作用相结合，并做了工艺上的改进，形成了一种独特的固定化工艺。与上述两种固定化程序不同，本发明中壳聚糖溶液与待固定物质的溶液或悬浮液先交联成凝胶状，再通过该凝胶在弱碱性环境下的硬化作用而自动脱水固化，再通过搅拌将凝胶分散成颗粒。分离出颗粒后，滤液澄清，在显微镜下滤液中看不到菌体残留。该颗粒具有很好的强度和过滤性能，通过机械粉碎成更小颗粒后仍保持合适的强度和过滤性能。

尤其需要说明的是，本发明可以直接将发酵液中的菌体或蛋白成分固定化，避免了发酵液工业化收菌的困难，对于工业酶制剂的开发具有很大的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合于工业化生产操作的固定化方法。以壳聚糖为载体，与目标物质经充分交联后，再固化分散成颗粒。本发明具有普遍适用性，可用于酶、细胞、菌体、发酵液及蛋白质等物质的固定化。

本发明通过以下技术方案解决上述问题：

一种以壳聚糖为载体的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.制备待固定的壳聚糖溶液：

1)向壳聚糖中加入酸，配制成壳聚糖溶液，

2)准备待固定物质的溶液或悬浮液，

3)将上述1)的溶液与待固定物质的溶液或悬浮液直接混合；

b.交联：将交联剂与上述步骤a得到的混合物混合，进行反应，反应完成后的混合物呈凝胶状；

c.向上述步骤b得到的凝胶状混合物中加入碱性物质，搅拌使凝胶固化分散成颗粒状，收集颗粒状的交联壳聚糖；

d.可选择地，通过粉碎、切割或者过筛方法将上述步骤c得到的交联壳聚糖再加工成各种形态的颗粒或粉末。

本发明的固定化方法中，所述待固定物质选自酶、细胞、菌体、发酵液或蛋白质。

一般常用的酸都可以实现本发明，优选自冰醋酸、盐酸或硫酸，更优选体积比0.1-80％的冰醋酸水溶液。

一般常规的碱性物质都可以实现本发明，优选能与壳聚糖溶液反应生成气体的物质，如碳酸钠和/或碳酸氢钠的固体或溶液，这样可以达到更好的固定化效果，又不会剧烈改变pH而对生物活性造成大的影响。