[发明专利]一种高产聚谷氨酸工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用微生物和发酵工程领域中一种重组γ-聚谷氨酸生产菌及其构建方法与利用该菌发酵生产γ-聚谷氨酸的应用，属于生物技术领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸(聚-γ-谷氨酸，poly-γ-glutamic acid，简称PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物。分子量分布在100kDa到10000kDa之间。聚-γ-谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。

PGA作为具有广泛应用前景的生物大分子物质，其生产主要包括以下几种方式：化学合成法，提取法和微生物发酵法。化学合成法制备PGA面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低，难于满足市场的需求。因此该方法不具备实际应用价值。提取法制备PGA的过程相对较为简单。该方法的主要缺点是上述菌体中节含量较低且不稳定，因此该方法制备PGA的产量较低，成本较高，不利于工业化大生产。

微生物发酵法是通过某些微生物的发酵培养生产PGA，与上述的多种方法相比，具有培养条件温和，周期较短，PGA产量高且分子量分布合适等优点，已经成为国内外研究的热点。微生物发酵法是目前制备PGA最具有工业化前景的生产方法。日本味之素株式会社和台湾味丹企业已经利用该方法进行PGA的商业化试生产。但是由于微生物中PGA的合成代谢途径较为复杂，涉及能量代谢，发酵液中PGA浓度相对较低，而且发酵液的黏度较高，限制了对氧的利用率，因此导致PGA产率较低。

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)是原核生物中迄今发现的唯一的一种血红蛋白。该蛋白能够从分子水平上提高基因克隆菌对氧气的利用能力，在贫氧环境中，能够诱导透明颤菌血红蛋白基因的表达，促进微生物细胞胞内氧的传输，提高氧的利用率，在限氧条件下，对许多宿主细胞的生长都有明显的促进作用。因此可以利用VHb的分子克隆来解决高黏度发酵过程中的供氧问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种γ-聚谷氨酸生产工程菌株的构建方法，该工程菌株可在较低溶氧水平下大幅度提高γ-聚谷氨酸的产量。

本发明所提供的高产γ-聚谷氨酸的工程菌，是将含有启动子、同源重组序列和筛选标记的透明颤菌血红蛋白基因重组到γ-聚谷氨酸生产菌株-枯草芽孢杆菌或其他可用来生产γ-聚谷氨酸的菌株的基因组上，经筛选得到的高产γ-聚谷氨酸的工程菌株。上述透明颤菌基因具有GENBANK Aceession Number为M30794的5′端第142-582位核苷酸序列。

上述的透明颤菌血红蛋白基因的5′端连接有P43启动子，P43启动子具有GENBANKAceession Number为K02174的5′端第1～476位核苷酸序列，其可在聚谷氨酸生产菌中启动下游基因的表达。透明颤菌血红蛋白基因含有的同源重组序列为淀粉酶(amyE)位点或lacA位点，筛选标记为氯霉素抗性基因。

本发明中的γ-聚谷氨酸生产菌株为枯草芽孢杆菌或其他可用来生产γ-聚谷氨酸的菌株，特别指枯草芽孢杆菌。

本发明将透明颤菌血红蛋白基因构建枯草芽孢杆菌同源重组载体为pBluescriptsk(+)-amyE-P43-vgb-cat-amyE，又名为pSK-P43-vgb。重组载体pSK-P43-vgb可通过电转化方法导入γ-聚谷氨酸生产菌株内。

附图说明

附图为pBluescriptsk(+)-amyE-P43-vgb-cat-amyE的结构图。

具体实施方式

下述实施例中所用的方法无特别说明均为常规方法。

实施例一：表达血红蛋白基因的枯草芽孢杆菌整合载体的构建