[发明专利]体外扩增造血干细胞和前体细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞体外扩增的方法，具体是指一种将从人外周血或骨髓中分离的造 血干细胞和前体细胞与内皮细胞共同培养来扩增造血干细胞和前体细胞。

技术背景

成熟血细胞的形成是一个非常复杂的过程，血细胞成熟的过程主要发生骨髓之中。造血 干细胞通过增殖和分化，生成不同类型的成熟的血细胞。造血干细胞和前体细胞具有广泛和 长期的自我更新能力，和分化为所有淋巴细胞的能力。CD34标记的造血细胞表面抗原是造血 干细胞和前体细胞的重要标记。骨髓中1-5％的细胞表达CD34抗原，外周血中0.1-0.5％的 细胞表达CD34抗原。CD34抗原在人血管内皮细胞中也有表达。这提供了人血管内皮细胞和 造血干细胞之间相互作用的物质基础。体外纯化和扩增的CD34阳性干细胞和前体细胞可以输 回体内执行造血功能。

骨髓提供了干细胞分化，血细胞生成和干细胞自我更新的微环境。微环境中有两个主要组 成部分，淋巴造血因子和骨髓基质。骨髓基质由成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞和巨噬细 胞/单核细胞组成，这些细胞为干细胞提供了附着滋养层。这些异质细胞层可以为干细胞提供 长期有效的增殖和分化所需要的微环境。在骨髓基质中，造血干细胞和前体细胞进行自我更 新，增殖和分化。干细胞与滋养细胞的相互作用在这一过程中起重要作用。

医学界和生物学界对在体外建立培养体系培养，扩增和分化造血干细胞和前体细胞表现 出了很大的兴趣和热情。扩增和分化造血干细胞和前体细胞可用于人类疾病的治疗，例如骨 髓移植。大多数骨髓移植用来帮助病人在放射治疗和化疗之后恢复造血功能。因此骨髓移植 是一个治疗晚期恶性肿瘤治疗(包括血液和非血液)，骨髓的内在缺陷，以及骨髓外伤(例如， 辐射或毒素)重要的辅助手段。骨髓移植与基因治疗技术的结合已经对许多疾病的治疗带来 革命性的影响。

干细胞体外培养可分为两类，液体培养和基质共培养系统。在进行液体培养时，干细胞 和前体细胞生长在含有生长因子和细胞因子的液体介质中。虽然液体培养易于维护，在技术 上非常适合用于大规模扩增干细胞进行干细胞治疗，但这种方法生产的干细胞和前体细胞满 足不了长期移植的需要。因为这样培养出的干细胞迅速分化成为成熟细胞，不再具备全能性。 这可能是由于液体培养的条件下干细胞和前体细胞得不到生长和增殖分化所必需的微环境。 为了解决这一问题，本发明采用基质共培养系统。该基质中包含有内皮细胞，干细胞和前体 细胞，脂肪细胞，成纤维细胞和巨噬细胞，生长因子和/或细胞因子。

第一代的基质共培养系统(Dexter et al.，Ann.Rev.Cell Bio.3：423，1987)中基质 细胞的异质性使得这一培养体系中的微环境的影响很难分析。这个复杂的微环境也极大地妨 碍了对造血干细胞发育阶段影响元素的界定。尽管第一代的基质共培养系统能够长期持续生 产干细胞，但这些干细胞目前难以用于的治疗目的。首先，该系统中的细胞微环境非常复杂， 难以进行大幅改善。二，该系统中需要建立的基质往往需要几个星期，阻碍了大规模治疗的 应用。最后，该系统生产的干细胞数量很少，不能满足治疗的需要。

为了克服第一代基质共培养系统的复杂性，Schwartz，Roller和Koller等人设计了灌 注生物反应器系统，该系统可以保证干细胞和前体细胞生长在一个可以控制的微环境中。然 而，这些灌注生物反应器系统只是对液体培养体系做了简单的修正，还是无法大规模扩增干 细胞和前体细胞。这也限制了干细胞和前体细胞在骨髓移植和基因治疗中的应用。因此，有 必要发明一个体外培养系统满足临床对造血干细胞和前体细胞的需求。

发明内容