[发明专利]一种鳖甲抗肝纤维化提取物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种鳖甲抗肝纤维化有效物质的的提取制备方法，具体是涉及一种鳖 甲中能显著抑制肝星状细胞(HSC)活化增殖及胶原合成、发挥防治肝纤维化作用的活性 部位的提取制备方法。

背景技术

肝纤维化是各种原因引起的一系列损伤-修复、导致细胞外基质(ECM)合成与降解失 衡、合成沉积远远超过降解吸收、以及构成成分比例明显改变的结果，大量ECM沉积于肝 小叶内并逐渐形成纤维间隔，严重破坏了肝组织的正常结构和功能，可致肝窦毛细血管化， 血流障碍，门脉高压。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础，也是诱发肝硬化和肝 癌的必经途径。肝纤维化治疗主要包括去除病因与抗纤维化治疗。公认彻底驱除原发病因 后，肝纤维化仍可继续进展，机理为活化的肝星状细胞通过自分泌或旁分泌再次激活HSC， 是故有效的抗纤维化治疗成为控制慢性肝病进展和预防肝硬化肝癌、改善预后不可或缺的 重要环节。基因治疗研究取得较大进展，目前存在的主要问题有基因导入的靶向性、表达 效率、可调控性及安全性尚未完全解决，真正应用于临床还待时日；目前部分用治肝纤维 化的化学药和生物药存在一些毒副反应；许多以鳖甲为君药组方的复方制剂如复方鳖甲软 肝片、鳖甲抗纤方、鳖甲煎丸等，抗肝纤维化疗效较好，但存在药效物质基础不明确、质 量控制标准不完善、药物疗效不稳定、临床服用剂量过大、价格较昂贵等弊端，难以满足 广大患者尤其是农村和贫困地区患者的需求，据统计我国约1.3亿人患有肝病，占总人口 的10％，针对国情，亟待开发价廉、有效且毒副作用小的抗肝纤维化药物。

鳖甲为常用传统中药，源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲， 具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸等功效；主治阴虚发热、劳热骨蒸、虚风内动、癥瘕、 久疟疟母等病症。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种鳖甲抗肝纤维化提取物的制 备方法，尤其是一种鳖甲抗肝纤维化有效物质的制备方法，并鉴定了鳖甲抗肝纤维化活性 部位为分子量小于6000的肽类物质，从而为诠释鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础提供了 科学依据，并为将鳖甲研究开发成高科技含量抗肝纤维化药物奠定坚实基础。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的；

一种抗肝纤维化的鳖甲提取物的提取方法，该方法包括：

(1)称取常规研磨的鳖甲粉50~100重量份，加蒸馏水200~300重量份，超声提取5~30 分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水50~300重量份，超声提取5~15分钟，抽滤；合并两次产生 的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；

(2)用加蒸馏水50~300重量份溶解上述的冻干粉，将水溶液装于半透膜() 内，置100~150重量份蒸馏水中透析1~10小时，温度为2~10℃；同法再透析一次，合并 两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.2~10重量份。

本发明取上述膜内液体，将膜袋置50~100重量份蒸馏水中透析1~6小时，温度为 2~10℃；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉0.5~10 重量份。

A型冻干粉为分子量小于6000的物质，即鳖甲粗多肽成品；B型冻干粉为分子量大于 6000的物质。

本发明项目的药理实验结果显示，与对照组相比，分子量小于6000的鳖甲多肽类物 质及其分离组分，能明显抑制肝星状细胞增殖，显著下调转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺 激的LX-1细胞I、III型胶原、α-肌动球蛋白(α-SMA)蛋白表达，呈现量效关系，在较 高实验浓度时作用显著强于公认有效的抗肝纤维化药物/细胞因子γ-干忧素(IFN-γ)。表 明鳖甲活性物质抗肝纤维化作用可能是通过阻断TGF-β₁在HSC内的Smad、MAPK信号转导， 阻止HSC向肌成纤维细胞(MFB)转化，使I、III型胶原等基因表达明显下调，减少胶原 合成分泌与促进胶原降解，达到抗肝纤维化目的。