[发明专利]一种腈水解酶基因、载体、工程菌及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种编码腈水解酶的腈水解酶基因、含有该基因的重组载 体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组腈水解酶 中的应用。

(二)背景技术

腈水解酶(EC 3.5.5)能够催化腈水解生成相应的羧酸和氨，是一类 在自然界中广泛存在的水解酶。腈水解酶是具有广泛的底物适应性的生物 催化剂，由于天然腈化合物的广泛存在，为发现和利用这种具有降解腈化 合物的酶提供和创造了有利的条件。腈水解酶具有立体选择性，利用这一 特点，它可以催化合成各种光学纯的酸。腈水解酶高效单一的反应，优良 的选择性使之在有机合成中表现出巨大的应用潜力，不仅具有广泛的工业 应用前景，而且也可以发展为合成手性分子及手性化合物的有力工具。

腈水解酶在自然界广泛存在。植物中主要有大麦科、十字花科、香蕉 科以及萝卜、燕麦、小麦的秧苗等。最近发现昆虫和人体内也存在腈水解 酶。腈水解酶最多的来源是微生物，第一个能产腈水解酶的微生物菌种是 可以利用天然腈化合物蓖麻碱(N-甲基-3-氰基-4-甲氧基-2-吡啶酮)作为 唯一碳源筛选得到的假单孢菌(Pseudomonas)。可以产生腈水解酶的微 生物菌株还有红球菌属(Rhodococcus)、杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏 菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、食酸菌属(Acinetobacter)、 以及曲霉菌属(Aspergillus)和青霉菌属(Penicillium)等。在不同底物 的诱导下，同一微生物来源的腈水解酶有不同的活性。

腈水解酶活性中心含有Glu-Lys-Cys三个残基，腈水解酶中的半胱氨 酸残基上的巯基有强亲核性，使整个催化水解反应过程类似于一般化学反 应中碱催化下的氰基水解，巯基首先亲核进攻腈中的碳原子形成酶-亚胺 中间体，再水合产生四面体中间体，该中间体除去氨转变为酰基-酶中间 体，后者水解产生羧酸，并使酶恢复原形。腈水解酶的活性部位不合金属 离子，因此绝大多数金属离子及金属离子螯合剂如氰基、重氮基、EDTA 等对酶活力都没有抑制作用。

目前已经有多种腈水解酶基因被克隆和测序，并且实现了在不同宿主 中的表达。为了进一步研究腈水解酶的结构、探索酶的功能、并对酶进行 改良，国内外不少研究者尝试利用基因突变技术对腈水解酶基因进行改 造。1992年，Michihiko等克隆了Rhodococcus rhodochrous K22的腈水解 酶并利用定点突变的方法对该酶进行了研究，结果发现，cys170位于该 酶的活性位点上。张锐等人在进行腈水解酶bxn基因克隆和改造时发现： 4处突变中2处突变能使基因表达产物丧失功能，1处使基因表达产物活 性降低，1处对基因表达产物活性基本无影响。进一步将完全回复突变的 bxn基因转化烟草，获得的转基因烟草具有抗溴苯腈除草剂特性，结果证 明结构中的3处突变与活性中心功能有关。但由于定点突变位点的选择比 较困难，再加上研究周期长、效率低，因此在腈水解酶的应用方面尚没有 突破。

在腈水解酶家族中，由于目前发现的腈水解酶存在酶活较低，而且稳 定性较差等问题，利用腈水解酶进行大规模的工业化生产存在一定的难 度，这使得构建腈水解酶基因工程菌具有重要意义，利用基因工程的手段 来改善野生型产腈水解酶菌株的不足，为腈水解酶的工业化应用提供了新 思路并奠定了基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种腈水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重 组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组腈水解酶中的应 用。

本发明采用的技术方案是：

一种腈水解酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

该腈水解酶基因由如下方法得到：利用PCR技术，在引物1 (ATGGATCACCCGAAATTCAAAGC)、引物2(AATACCTTC TTGGTCAGTCGGC)的作用下，以来源于节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)CCTCCM208252菌株中的总基因组DNA为模板克隆 长约0.8kb的腈水解酶基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上获得 克隆载体pMD18-T-NIT和转化了pMD18-T-NIT的重组大肠杆菌。对重 组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为 819bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为：