[发明专利]来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞

说明书

本申请是国际申请号为PCT/US 02/20998、国际申请日为2002年7月3日、 进入中国国家阶段的申请号为02813555.5、名称为“来自人胚胎干细胞的间充质 细胞和成骨细胞”的发明专利申请的分案申请。

相关应用的参考

本发明要求提交于2001年7月6日的待审批美国临时专利申请60/202,732的 优先权。为在美国和其它允许权限中实行起见，优先权申请全部和WO01/51616 一起纳入本文作为参考。

技术领域

本发明一般涉及胚胎细胞和间充质祖细胞的细胞生物领域。更具体的，本发 明涉及人多能干细胞形成成骨细胞和其它细胞类型的定向分化，使用特殊培养条 件和选择技术。

背景技术

再生性药物是生物技术产业的重要新开端。开发了方法来产生特殊细胞的培 养物，这些细胞计划用于促进组织修复和治愈以前药物治疗不满意的疾病。

产生兴趣的领域是使用培养的细胞来提高或修复骨组织。有一些出版的报导 关于正在研制中的成骨细胞祖细胞和间充质干细胞。

美国专利5,691,175、5,681,701和5,693,511(Mayo基金会)描述了无限增殖的 正常人胎儿成骨细胞，它们表达猿病毒40大T抗原的温度-敏感突变体。美国专 利5,972,703(Michigan)报导了不是造血的骨前体细胞组成，它们可在暴露于骨生长 因子的时候分化成成骨细胞，使钙沉积到胞外基质中。美国专利6,200,602(Du Puy 矫形学)报导了来自造血和非造血细胞的软骨或骨前体细胞的分离以及建议它们 用于骨和软骨再生。

国际专利出版物WO95/22611(Michigan)报导了将核酸原位转移到骨细胞用于 刺激骨祖细胞的方法。研究了II型胶原和亲骨基因用于动物模型中促进骨生长、 修复和再生。国际专利出版物WO99/30724(Oregon)建议用成骨细胞祖细胞治疗骨 缺陷。可转化细胞以表达骨形态发生蛋白，如BMP-2。

骨干细胞的主题由J.E.Aubin综述(J.Cell Biochem.Suppl.30/31:73,1998)。干和 原始骨原细胞和相关间充质前体有助于在骨更新和骨折治愈中置换成骨细胞。文 章提出假设，成熟成骨细胞表型与表达已知成骨细胞标记亚型的成骨细胞亚群异 源，提高多种平行分化途径和不同祖细胞库的可能性。

Joyner等(Bone21:1,1997)报导用分化阶段-特异单克隆抗体鉴定和富集人骨原 细胞。特定抗原的选择是根据其与骨髓培养物的反应性和成骨细胞附近祖细胞区 域的胎儿组织中免疫组织化学定位。在免疫淘选(immunopanning)中，抗体选择间 质成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)。Thies等(Endocrinology130:1318,1992)报导 骨形态发生蛋白-2诱导间质细胞系中成骨细胞分化，以剂量-依赖方式增加碱性磷 酸酶活性而不影响细胞增殖。

Liechty等(Nature Med.6:1282,2000)报导了人间充质干细胞(MSC)移植并证明 羊子宫移植后的位置-特异分化。通过髂嵴吸气从正常人供体获得MSC群，在产 生免疫活性前移植到羊中。移植的细胞在多组织中持续13个月。文章报导它们经 历位置-特异分化成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞、骨髓间质细胞和胸 腺间质。

美国专利5,908,784(Case Western Reserve)涉及获得人MSCs，这是通过取骨髓 细胞、使它们生长在有胎牛血清的BGJ_b培养基中并用单克隆抗体鉴定它们。体外 诱导软骨细胞包括使压紧的细胞沉淀接触软骨诱导剂。美国专利5,486,359(Osirls 疗法)报道了分离可分化成骨、软骨、肌肉或骨髓间质的人间充质干细胞。国际专 利出版物WO97/40137(Osirls)提出了一个使用间充质干细胞来再生和增加骨的系 统。组合物包括MSCs或结合陶瓷材料或可再吸收生物聚合物的新鲜骨髓细胞。

不清楚这些出版物中作为例子的任何细胞制备是否可以足够量产生作为骨修 复治疗组合物大量上市。

胚胎来源的未分化多能干细胞