[发明专利]无哺乳动物源成分的溶组织梭菌生长培养基

说明书

技术领域

本发明在微生物学领域内。具体而言，本发明涉及溶组织梭菌 (Clostridium histolyticum)培养基最优化。

背景技术

梭菌属(Clostridium)包括杆状革兰氏阳性细菌，所述细菌为能够产 生内生孢子的专性厌氧菌。梭菌属包括普通的自由生活的细菌和重要的 病原体，其包括肉毒梭菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气 荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)和溶组织梭菌。已知 后者产生胶原酶，所述胶原酶是外毒素，并且例如通过促进气性坏疽传 播而起到毒力因子的作用。胶原酶通常靶向肌细胞和其他身体器官的结 缔组织。由于对结缔组织的强力水解活性，将胶原酶和其他蛋白酶例如 嗜热菌蛋白酶用于体外的组织解离。

可以从土壤分离溶组织梭菌。然而，在伤口中罕见细菌。溶组织梭 菌不是严格厌氧的，并且可以在需氧温育的培养基中微弱生长。在培养 中，蛋白质和肽是溶组织梭菌的主要碳源，所述溶组织梭菌分泌多种能 够水解肽键的酶。

关于技术应用，来自溶组织梭菌的胶原酶即I型和II型胶原酶对于 例如器官组织的体外解离特别重要。重要的是，胰组织的胶原酶消化目 前用于人胰岛细胞的制备和分离。然而，许多其他不同的特定细胞类型 也被从伴随的结缔组织分离，包括来自脂肪组织的脂肪细胞、来自肝的 肝细胞、来自软骨的软骨细胞、来自心脏的肌细胞，以及来自骨的成骨 细胞。

一个实用的优点是，可以在简单的液体培养基中大量培养溶组织梭 菌，且其有规律地产生分泌到培养基中的大量蛋白水解酶。

RO51768公开了用于培养溶组织梭菌以产生胶原酶的培养基，其中 培养基含有蛋白胨和石蜡油。

RU2180002公开了用于发酵和纯化溶组织梭菌胶原酶的培养基，所 述培养基含有酪蛋白和大豆油饼水解产物。其他成分是磷酸二氢钠一水 合物、磷酸氢钾二水合物、吡哆醇、核黄素、溴化硫胺素、叶酸、泛酸 钙、烟酸、硫辛酸和生物素。

WO2003/025136公开了基于明胶的发酵培养基，用于从噬胶梭菌 (Clostridium collagenovorans)产生纤维素和胶原酶。

WO2007/089851公开了用于溶组织梭菌发酵的培养基组合物和方 法。该培养基的蛋白质成分包括植胨蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、 胰蛋白胨和各种植物提取物。发现猪衍生的蛋白胨支持溶组织梭菌株 的生长，所述溶组织梭菌株在这些条件下将胶原酶分泌到培养液中。为 了减少共分泌的梭菌蛋白酶的含量，具有蛋白胨的培养基被最优化。

溶组织梭菌培养从历史上要求使用动物衍生的产物，例如脑心浸液 (例如Jozwiak，J.等人，Enzyme and Microbial Technology 39(2006) 28-31)。然而，对培养基中哺乳动物来源蛋白质材料的要求引起了对培 养基可能污染的担忧。具体而言，对于培养基可能被任何传染性海绵状 脑病(TSE)病原体或其他传染性和有害试剂所污染的担忧，限制了来 源于这类培养物的任何因子的有用性，尤其是在治疗应用中的有用性。

因此，现有技术的溶组织梭菌培养基具有某些缺点。考虑到这一点， 本发明的目的是提供培养基的备选组合物以支持溶组织梭菌的生长。本 发明的特别焦点是提供不含哺乳动物衍生的成分的生长培养基。另外， 本发明以提供可用于溶组织梭菌发酵的液体培养基为目标。此外，本发 明目的是提供一种培养基，该培养基支持具有胶原酶活性的酶向培养基 中的分泌、并且优选以允许从培养物上清液大规模经济地纯化该酶的量 分泌。

发明人已惊讶地发现，鱼明胶和衍生自非哺乳动物源的蛋白胨的组 合解决了上述技术问题。

发明内容