[发明专利]新型细胞凋亡检测试剂及相关试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更确切地说基于现代生物化学技术和现代蛋白质化学技术制备细胞凋亡检测试剂，并形成相应的细胞凋亡检测试剂盒，其制备及应用特点。 

一、人膜联蛋白V(Annexin V)的背景知识 

人膜联蛋白是一种钙离子依赖性膜磷脂结合蛋白质。它分布广泛，在多种组织细胞(如心肌细胞、血管内皮、骨骼肌、肝细胞等)中有表达。人膜联蛋白V是人体内存在的一种蛋白质，共由319个氨基酸残基组成，分子量约为36kDalton，等电点4.71[Rand J H.“Annexinopathies”a new class of diseases[J].Nature，1999，340(13)：1035-1036.]。它含有一个半胱氨酸残基，位于第四个重复序列中。在四级结构中，此半胱氨酸残基被埋藏在分子内部，只有在变性条件下，它才暴露在表面，允许人膜联蛋白V形成同源二聚体。人膜联蛋白V只含有一个潜在的糖基化位点，但它是一个非糖基化蛋白。人膜联蛋白V最早由胎盘分离出来[Yue YF，Jiang H，Shi L，et al.Study on the mechanism of intrauterine infection of hepatitis B virus[J].Chin JObstet Gynecol，2004，39(4)：224，6.]。从上世纪80年代开始，人们对人膜联蛋白V的功能和结构进行了研究[Fadok VA，Savill JS，Haslett C，et al.Differnt populations of macrphages use eitherthe vitrotin receptor or the phosphatidylaerine rceptor to rcognize and rmove apoptotic cells[J].JImmoral，1992，149：4029；De Meyer S.Influence of the administration of human annexin V on invitro binding of small hepatitis B surface antigen to human and to rat hepatocyte.[J]Viral Hepat，2000，7(2)：104；Patel S K，Ma N，Monks T J，et al.Changes in gene expression during Chemicalinduced nephrocarcinogenicity in the Eker rat[J].Mol Car cinog，2003，38(3)：141-154.]。人膜联蛋白V的cDNA已经被确定。[Liu JY.Yang Liu F，et al.Preparation of recombinat protein ofextracellular ligand binding domains of mouse VEGF receptor 2 a nd its application[J].ChinaJournal of Modern Medicine，2003，12(24)：21.]。人膜联蛋白V的两个结构域位于其N端的尾部和C端的核心区。C端结构域是高度保守的，同人膜联蛋白家族中的其他成员一样，都是由4个含有约70个氨基酸残基组成的重复序列构成。而N端序列的同源性却小于5％[HawkinsTE，Christien J，Merrifield，et al.Calcium signaling and annexins[J].Cell Biophys，2000，33：275-296.]。另外，在其N端含有两个苏氨酸残基，但是在标准的磷酸化条件下，不能被磷酸化。人膜联蛋白V不含有信号肽和可能跨越磷脂双分子层的疏水序列，但它能被分泌到胞外，其机制目前仍不十分清楚。天然来源的人膜联蛋白V含量低，无法批量提供。目前人膜联蛋白 V的制备一般是通过基因工程技术在大肠杆菌中对人膜联蛋白V基因进行直接表达，进一步地，再对其表达产物形成的包涵体进行变复性处理，以及后期一系列的纯化步骤，最终制备人膜联蛋白V蛋白质[陈大明，谢虹，祁本忠，张颖梅，贾兵，杨红伟，罗志福，张锦荣，金小海，王凡，马大龙。细胞凋亡检测蛋白AnnexinV的制备纯化和初步评价。原子能科学技术，38，Sup1，182-187]。纯化工艺相对复杂，并且存在包涵体变复性处理，对其分子结构有一定影响，对后期蛋白的得率也有较大影响。目前，人膜联蛋白V经过FITC或者PI标记后，用于体外细胞凋亡的检测分析，同时，放射性标记人膜联蛋白V的核医学显像还用于体内生物活体的细胞凋亡检测分析。放射性人膜联蛋白V的核医学显像剂主要包括99Tcm和碘(^{123，124，125，131}I)以及¹⁸F标记的人膜联蛋白V[Blankeneberg FG，Katsikis PD，TaitJF，et al.Invivo dictation during programmed cell death[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95，6349-6354]。