[发明专利]一种调控表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种调控表达蛋白酶的构建方法，尤其是调控表达丙型肝炎病毒 NS3/NS4A蛋白酶的构建方法及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒是引起慢性肝病的主要病原体，严重危害人类健康，已成为全球性的、 重要的公共卫生问题，迄今，尚缺乏有效的抗病毒治疗措施及有效的疫苗。

目前HCV最有效的治疗仅仅是干扰素和利巴韦林联合使用，效果在不同基因型之间 有很大差异，疗效低于40％，而且副作用非常大。随着临床上蛋白酶和逆转录酶抑制 剂在治疗HIV中的应用及取得的良好疗效，近年来以在病毒基因组复制和多聚蛋白前体 加工成熟中起着关键作用的酶类(如丝氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA聚合酶)为靶点，寻 找特异有效的治疗药物已经成为HCV防治研究的重要方向。

HCV NS3蛋白的编码基因全长共1893个核苷酸，位于基因组序列的nt 3420～5312 位点，编码631个氨基酸的NS3蛋白。NS3蛋白近N端1/3(aa 1～180)具有丝氨酸蛋 白酶活性，近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和解旋酶(Helicase)活性。NS3蛋白 发挥蛋白水解酶功能需与NS4A蛋白协同，将多聚蛋白前体的非结构蛋白切割成为成熟 蛋白。鉴于HCV NS3/NS4A蛋白具有多功能生物活性，在HCV基因组的复制与多聚蛋白 前体的加工成熟中有着重要的作用。还可以反式激活宿主细胞内多种基因的表达，对肝 细胞的生长、代谢、甚至是恶性转化产生重要影响，近年来，它已经成为抗HCV感染研 究的主要靶位。而有研究表明HCV NS3/NS4A蛋白酶抑制剂可明显降低HCV的病毒水平， 因此建立表达丙型肝炎病毒HCV NS3/NS4A蛋白酶的方法对筛选抗HCV药物和研究 NS3/4A蛋白酶功能有重要意义。

长期以来，由于缺乏稳定、可靠的动物模型，极大地制约着对HCV致病机制、搞病 毒药物筛选和疫苗等研究的深入和发展。

目前，HCV动物模型的研究主要集中在感染动物模型、人-鼠肝脏嵌合小鼠模型和 转基因小鼠模型三个方面。由于感染动物模型所采用的黑猩猩来源不便，及嵌合小鼠模 型操作难度大，成本高等原因，应用上存在很大的局限性。HCV转基因小鼠是目前研究 应用最多且相对成熟的动物模型。

转基因动物是指以实验方法，把外源基因导入到动物体内，这种外源基因与动物本 身的染色体整合，外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给子代。 自1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术以来，转 基因动物研究在许多领域都取得了令人瞩目的成就，并在诸多领域具有广阔的应用前 景。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，并可以用来建立多种疾病的动 物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可调控型表达HCV蛋白酶的构建方法，所述转基因小鼠的 基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在所述目的基因HCV NS3/ NS4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素存下表达活性的HCV NS3/ NS4A蛋白酶。本发明还涉及所述转基因动物的筛选及评价方法以及构建该可调控型表 达HCV蛋白酶转基因小鼠模型在HCV致病机理研究和药物的筛选与评价中的应用。

本发明的目的是通过下述方法实现的，调控表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的 构建方法，其特征在于：将运用双重调控系统表达HCV NS3/NS4A蛋白酶的真核表达载 体导入小鼠基因组，由此获得的HCV NS3/NS4A转基因小鼠模型可用于与双转基因小 鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并用于HCV致病机理研究和药物的筛选与评价。

所述转基因动物的基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在 所述目的基因HCV NS3/NS4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素 存在下表达活性的NS3/NS4A蛋白酶。该蛋白酶是在肝脏内特异性表达活性的HCV NS3/NS4A蛋白酶。

所述转基因动物的基因组中含有萤光素酶报告基因和β-半乳糖苷酶报告基因； 能在启动萤光素酶报告基因表达的同时，也能启动β-半乳糖苷酶报告基因的表达， 双报告基因的设计易于筛选。

所述构建调控序列包含LoxP位点、Luciferase和polyA序列，受Tet和Cre/LoxP 系统双重调控表达。