[发明专利]筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，特别是一种筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法，以及用于筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的筛选模型。具体而言，本发明涉及以谷氨酸棒杆菌为检定菌，以BHI(brain-heart infusion，脑心浸液)培养基和BHIS培养基为筛选介质，从微生物代谢产物及其他来源的样品中筛选作用于结核杆菌细胞壁核心的合成与组装过程中不同酶系、不同靶点的新型抗结核药物和先导化合物。本发明还涉及所述筛选模型的筛选方法以及筛选标准。

背景技术

结核杆菌的细胞壁对于其生长繁殖至关重要，细胞壁各成分的合成与组装过程中有众多的酶系参与^[1]，潜在着多个抗结核药物的新靶点，而且其中多数的酶是人体内所不存在的，因此靶向结核杆菌细胞壁的药物具有较好的选择毒性。

研究表明：当参与细胞壁合成与组装受阻，细胞壁因此而变薄或者缺失，导致菌体渗透压的失衡，对结核分枝杆菌(Mycobacterium.tuberculosis)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的表现为死亡；对于谷氨酸棒杆菌则表现为生长缓慢；该效应可通过在培养基中增加山梨醇(一种渗透压维持剂)得以补偿，使之生长速度恢复并维持细胞形态^[2]。例如，AftB作为阿拉伯糖层连接最后一个阿拉伯糖的酶，它的缺失会导致分枝菌酸层的缺失和生长速度的变慢，当培养基中添加山梨醇后，其生长速度几乎可以完全被回复^[3]。

但现有技术中还缺少筛选靶向结核杆菌全细胞壁的药物的方法，特别是筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，更具体而言涉及一种筛选靶向结核杆菌细胞壁的药物的方法。

本发明还涉及一种用于筛选靶向结核杆菌细胞壁的药物的模型。基于谷氨酸棒杆菌野生株细胞壁发生缺失导致的生长速度变慢，可以由在培养基中添加渗透压维持剂，如山梨醇，加以补偿的效应，我们成功的构建了一个细胞水平的高通量筛选模型，经过筛选，得到了一些活性物质，并通过分枝菌酸甲基酯分析，确证了这些活性物质的作用靶点在细胞壁上。

对于上文所述的渗透压维持剂，通常使用蔗糖、山梨醇以及无机盐粒子，如钠盐、钾盐、钙盐等。在一个具体的实施方式中，本发明使用山梨醇作为渗透压维持剂。

在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法可以包括分别在有和无山梨醇存在的情况下，将检定菌，例如野生型谷氨酸棒杆菌和候选化合物接触，并测定对所述细菌的抑制。其中所述的抑制，例如是对上述菌株的生长、繁殖的速度的抑制。其中选择在有山梨醇情况下，不抑制检定菌，而在无山梨醇情况下抑制检定菌的候选化合物。

在一个具体的实施方式中，所述方法还可以包括阳性对照实验，其中使用的阳性对照化合物例如是乙胺丁醇。

在一个具体的实施方式中，将检定菌在含有渗透压维持剂，例如山梨醇和不含补偿化合物的培养基中与候选化合物或阳性对照化合物共培养，并测定检定菌的生长、繁殖的速度，从而测定对检定菌的抑制。

在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法还可以包括筛选后的候选化合物对草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌的生长抑制的验证实验。

在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法还可以包括筛选后的候选化合物野生型谷氨酸棒杆菌进行细胞壁成分分析，如分枝菌酸甲基酯分析。

在一个具体的实施方式中，首先，本发明的筛选方法可以包括在多孔板上进行检定菌与候选化合物或阳性对照化合物共培养，其中使用的培养基可以是BHI和BHIS培养基，通过测定544nm处的吸光度来测定检定菌的生长。其中优选的多孔板是96孔板。

其中所述96孔板法中，使用BHI和BHIS培养基，乙胺丁醇的浓度为1μg/ml，在37℃，培养12h后，用酶标仪测定544nm处的吸收，按照如下公式分别计算抑制率，

抑制率差为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS培养集中的抑制率作为抑制率差表示活性差异，其中抑制率差大于10％的待筛样品为阳性药物。

在另一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法可以包括使用纸片法，在纸片上进行检定菌与候选化合物或阳性对照化合物共培养，其中使用的培养基是固体培养基，通过测定抑菌圈的大小来测定检定菌的生长。其中优选的固体培养基可以是BHI和BHIS培养基添加琼脂粉。