[发明专利]一种基于调脂抗氧化效应的降脂宁质量评价方法

权利要求书

1.一种基于调脂抗氧化效应的降脂宁质量检测方法，其特征在于该检测方 法为：

A、药效组分制备：

精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、荷叶碱、牡荆素、大黄 素甲醚、槲皮素，按质量比7～8∶2～3∶0.5～1∶0.2～0.5∶0.5～1∶0.5～1.5的比例混匀，用蒸馏水溶解， 配成相应浓度的储备液，用0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存，备用；

B、供试品制备：

取待检样品，加水溶解分散，通过树脂柱径高比为1∶6～10AB-8型或D-101型或HPD-300 型大孔吸附树脂柱，树脂体积与药量之比(ml∶g)为1∶0.5～1.5；待吸附完成，水液全部通过 树脂柱后，树脂柱先用3～6倍树脂体积水洗脱，水洗脱液弃去，树脂柱再用3～6倍树脂体积 的40～70％乙醇洗脱；收集40～70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，50℃减压干燥，得供试品； 取供试品用蒸馏水溶解后，配成相应浓度储备液，用0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存，备 用；

C、细胞培养：

将冻存的人脐静脉血管内皮细胞株EAHY926置37℃水浴中复苏，接种至培养皿中，置 37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养；待细胞长成致密单层后，传代培养，传代时弃 去原培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，加入0.125％/0.02％，1∶1的胰酶-EDTA消化液消化 5min，在倒置显微镜下观察，当出现细胞回缩或细胞间隙增大，且有少量细胞悬浮时，立即 弃去消化液，加入2倍于胰酶的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使成均匀的细胞悬液，吸 入离心管中在1000rpm，5min条件下离心，上清液弃去，用完全培养基重悬细胞后进行细胞 计数，以1～2×10⁶个细胞/mL的密度接种于新的培养皿中培养；每2～3d换液一次，长满后即 可再次传代；

将冻存的人肝细胞株Bel-7402置37℃水浴中复苏，按2×10⁵/mL接种于25cm²培养瓶中，培 养基为RPMI-1640完全培养基，其中含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素； 置37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，每2～3d换液一次；待细胞铺满培养瓶80％以上时， 用0.125％/0.02％，1∶1的胰酶-EDTA消化传代；选择对数生长期细胞用于实验；

D、调脂抗氧化生物效应测定：

分别取药效组分及供试品储备液配成相应剂量，按照抗氧化指标a、代谢物含量指标b平 行进行调脂抗氧化效应测定：

a抗氧化指标测定为：

细胞模型制备，用Ox-LDL氧化型低密度脂蛋白制备HUVEC细胞损伤模型；Ox-LDL原 始浓度为1～1.5mg/mL，4℃冰箱保存，备用；临用时稀释至80～100μg/mL；

分组，空白对照组：仅加入无血清培养基；模型对照组：仅加入Ox-LDL100μg/mL于无 血清培养基；阿托伐他汀对照组：无血清培养基中含阿托伐他汀1×10^-7mg/mL；供试品低、中、 高剂量组：无血清培养基分别含供试品2×10^-4，2×10^-3，1×10^-2mg/mL；药效组分低、中、高 剂量组：无血清培养基中分别含药效组分1×10^-4，1×10^-3，1×10^-2mg/mL；

Ox-LDL诱导损伤的HUVEC细胞活力测定：选择人脐静脉血管内皮细胞株常规细胞培养， 用Ox-LDL进行氧化损伤造模，用供试品及药效组分进行干预后，噻唑蓝比色法检测内皮细胞 活力；具体方法为：取培养后细胞，按100μL/孔1×10⁴接种于96孔培养板中，按“α抗氧化指 标测定分组”项下方法分为9组，每组6个平行孔；药物作用于细胞24h后，加入5mg/mL MTT 50μL继续培养4h，吸弃上清液，各孔加二甲基亚砜150μL，室温避光微振荡10min，使结晶充 分溶解，用酶标仪在570nm处测定OD值；由下列公式计算内皮细胞活力：内皮细胞活力％＝实 验组OD值/空白对照组OD值×100％；

Ox-LDL诱导损伤的HUVEC培养液NO、ET-1含量测定：选择人脐静脉血管内皮细胞株， 常规细胞培养，用Ox-LDL进行氧化损伤造模，用供试品及药效组分进行干预后，取培养上清 液，按试剂盒说明书检测NO、ET-1含量；具体方法为：取培养后细胞，按1×10⁶/mL接种于6 孔板，置37℃、5％CO₂培养箱培养24h，弃去原培养基，按“α抗氧化指标测定分组”项下 方法分为9组，每组3个平行孔，加入各药液，再置37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，取各孔细 胞培养上清液，2000rpm离心10min，取上清液分装于EP管中，4℃冰箱保存，备用；分别按 试剂盒说明书用分光光度法检测NO含量、用放射免疫分析法检测ET-1含量；

Ox-LDL诱导损伤的HUVEC内皮细胞MDA含量、SOD活力测定：选择人脐静脉血管内皮 细胞株，常规细胞培养，用Ox-LDL进行氧化损伤造模，用供试品及药效组分进行干预后，移 除培养液，按试剂盒说明书检测MDA含量、SOD活力；具体方法为：将移去培养基的细胞用 胰酶-EDTA消化液消化，用PBS洗下细胞，1000rpm离心5min收集细胞；每孔收集的细胞，加 入0.5mL双蒸水，用超声波粉碎仪粉碎细胞，3000rpm离心10min，取上清液分装于EP管中，4℃ 冰箱保存，备用；按试剂盒说明书用分光光度法分别测定MDA含量、SOD活力；

b代谢物含量指标测定为：

分组，空白对照组：含2g/L牛血清白蛋白的1640培养液；阿托伐他汀组：含2g/L BSA的 1640培养液加10^-7mg/mL阿托伐他汀；供试品高、中、低剂量组：含2g/L BSA的1640培养液分 别加入终浓度为1×10^-2mg/mL、2×10^-3mg/mL、2×10^-4mg/mL的供试品；药效组分高、中、低 剂量组：含2g/L BSA的1640培养液分别加入终浓度为1×10^-2mg/mL、1×10^-3mg/mL、 1×10^-4mg/mL的药效组分；每组做3个平行孔；

Bel-7402肝细胞内胆固醇含量测定：Bel-7402细胞在6孔板中培养24h，将每孔加入1mL 含有各组药物的无血清培养基，培养24h后，移除培养基，细胞用PBS洗涤2次，每孔加入 体积比为3∶2的正己烷-异丙醇1mL，室温下放置30min，分取有机溶剂，重复操作一次；合 并2次收集的有机溶剂，置玻璃管内吹干，用200μL甲醇复溶，测定胆固醇含量；提取了脂. 质的细胞加入0.1mol/LNaOH裂解后，用蛋白定量试剂盒测定细胞总蛋白浓度；胆固醇含量 采用HPLC法测定，色谱条件为：色谱柱：Hypersil APS2C₁₈150mm ×4.6mm，5μm；流动 相∶乙腈-异丙醇＝90∶10，流速：1.0mL·min^-1，柱温：25℃，检测波长：216nm；峰面积外标 法定量，以mg/g细胞蛋白为单位；

Bel-7402肝细胞内外TBA含量测定：采用酶法TBA试剂盒测定；Bel-7402细胞在6孔板中 培养24h后，每孔加入1mL含有各组药物的无血清培养基，培养24h后，收集培养基，分装于 EP管中，测定培养基中TBA；将移除培养基的细胞，用PBS洗涤2次，每孔加入300μL含 1％Triton-X100的双蒸水裂解后，收集液体，3000rpm，10min的条件下离心，分装于EP管中， 测定细胞内TBA，并用蛋白定量试剂盒测定细胞总蛋白浓度；细胞内TBA含量用每克细胞蛋 白所含TBA的μmol数表示；

E、供试品生物效价比计算和统计学分析：

将供试品经过与药效组分所确立的标准生物效应指标进行检测后，计算该供试品的生物 效价比并进行统计学分析；

F、供试品质量评价：

根据生物效价比及统计学分析结果进行供试品的质量评价；生物效价比范围及标准：效 价比＜80％，或经统计学检验与效应标准有显著性差异，为不合格品；效价比在80％～120％之 间，且经统计学检验与效应标准无显著性差异，为合格品；效价比＞120％，且经统计学检验 与效应标准无显著性差异，为优质品。