[发明专利]成熟miRNA定量检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域中一种标本中成熟miRNA的定量检测方法及试剂盒，可用于标本中成熟miRNA的表达量分析及临床检测。

背景技术

miRNA(microRNA)是一类非编码、内源性的小RNA，长约21～25核苷酸(nucleotides，nt)。目前已经被发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA有695种，绝大多数miRNA可以通过与靶基因的3-UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞及组织水平影响生物体的发育，并参与多种疾病的发生发展过程。一系列的研究表明miRNA在细胞成长、细胞分化及凋亡、同源异性盒基因调节、神经元极性、胰岛素分泌、胚胎发育中的大脑形成及心脏发生、代谢等过程中都发挥着重要作用。成熟miRNA作为体液中客观存在的标志物，其表达量的检测也将有很重要的临床意义。

自1993年首次发现miRNA以来，检测其表达水平的技术方法也发展了许多种，目前已有的检测方法主要有：(1)Northern杂交法：从1993年始，Northern杂交法就被应用于miRNA表达谱研究，也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术，通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测。而后，Northern杂交法成为检测细胞中miRNA表达的常规研究方法之一。但Northern杂交法最大的缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量需要达到40μg才会出现明显杂交信号；(2)原位杂交法：原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。该技术可以检测同一细胞系中单个细胞中的miRNA表达，也可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平，是分析miRNA表达的组织和时序特异性的有力工具。但其同样存在跟Northern杂交的缺点，那就是对样品的需求量高，很难在一般的检测实验中推广；(3)基因芯片：最初的miRNA基因芯片，是将反义DNA探针点在尼龙膜上，然后以5′端放射性标记的miRNA样品杂交，再经放射自显影获得信号。经过发展，基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于多个miRNA同时检测，但仍有很多不足之处：基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备、结果是半定量的、重复性较差、不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境、不能区分高度类似的miRNA等；(4)半定量RT-PCR：RT-PCR作为半定量检测miRNA表达的常用实验方法，在研究miRNA表达的过程中不断得到改进。半定量RT-PCR是常用的一种简洁、快速、特异的相对定量的RNA检测技术，有研究用该技术成功对比了待测和对照样本之间特异miRNA的表达差异，但只能测定miRNA的相对含量。该技术有以下优点：可在较短时间内获得结果；高通量，可同时检测多种miRNA的表达；与Northern杂交相比，仅需少量RNA，且不用放射性同位素标记；操作过程简单。但该技术检测miRNA表达时也有以下缺点：有的miRNA和其他miRNA具有同源区域，它们的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分，检测的特异性不容易控制，不能很好的区分标本中的成熟miRNA和前体miRNA。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可以特异性定量检测标本中成熟miRNA的简便、实用的方法及成套的试剂盒，可用于多种类型标本中成熟miRNA的表达量分析及临床检测。

本发明所涉及的miRNA检测方法，其特征在于：提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测成标本中成熟miRNA的含量。该检测方法通过以下技术方案实现：(1)总RNA提取：A、样品处理；B、RNA分离；C、RNA沉淀；D、RNA洗涤；E、RNA溶解；F、RNA浓度测定；G、RNA电泳检测。(2)RNA的逆转录：以一个包含20-230nt长度的发卡序列和6-30nt特异性序列的引物进行逆转录反应，扩增相应的成熟miRNA的第一链cDNA。(3)荧光定量PCR检测：以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中成熟miRNA的含量。检测的基本原理示意图见附图1，下面将通过一个具体实施方式详细描述该技术方案。