[发明专利]环孢菌素A的HPLC分析检测方法

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种环孢菌素A单位的HPLC分析检测方法。

背景技术

环孢菌素最早于1970年由瑞士Sandoz公司的科学家在光泽柱孢菌和多孔木霉发酵液中研究发现，1983年被美国FDA批准应用于临床肾移植，由于其良好的免疫抑制活性，作为第三代免疫抑制剂，取得了巨大的成功。其后，环孢菌素其他组分也受到科研工作者的重视，陆续发现了26个以上的天然环孢菌素组分(CsA、B……Z)。对于成分复杂的环孢菌素发酵液来说，建立一种方便、快捷、可靠的目标产物检测方法显得十分必要，特别是环孢菌素的同系物C、B、D结构与A十分相似，分离难度很大。

《河北医药》2006年10月第28卷第10期，《高效液相色谱法检测人全血环孢素A浓度》公开了一种检测全血环孢素A的方法，采用的色谱条件是：色谱柱：ZORBAX SB-C18(5)，4.6×150mm，紫外检测波长208nm，柱温70℃，流速1.4ml/min，流动相为乙腈∶甲醇∶水∶异丙醇：58∶18∶23∶1(V/V)。

《沈阳医学院学报》2006年6月第8卷第2期，《反相高效液相色谱法测定人环孢素A血药浓度》公开了一种测定人血液中环孢素A的方法，采用的色谱条件是：Sphefisorb.C8型色谱柱，检测波长为214nm，甲醇-水(75∶25，V/V)为流动相，柱温60℃。

总体而言，在现有技术中，环孢菌素A与同系物之间虽能较好分离，但分析方法时间较长，不但浪费时间和大量的溶剂，而且还会缩短色谱柱的使用寿命。特别是分析多个样品时，相互之间还会出现明显的干扰，影响分析的准确性。

发明内容

本发明的目的旨在提高样品中环孢菌素A单位分析的准确性和快速性，提供一种环孢菌素A方便、快捷、可靠的HPLC分析方法。

为了实现本发明的目的，通过大量试验研究，发明人提出了一种环孢菌素A的高效液相检测方法，所述高效液相检测方法采用如下色谱条件：

色谱柱：十八烷基键合硅胶的C8柱或C18柱；

检测波长：190～380nm，优选190-230nm；

流动相：磷酸二氢钠-乙腈缓冲液或磷酸二氢钠-甲醇缓冲液。

上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中检测器可以采用紫外检测器或二极管阵列检测器。

上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中所述流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝20％-40％∶60％-80％，或磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝20％-40％∶60％-0％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01～0.50mol/L，磷酸调pH值为2.0～3.0。优选地，流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝30％∶70％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01mol/L，磷酸调pH值为2.7。

上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中流动相的流速为0.5ml/min～1.5ml/min，柱温为25～35℃。优选地，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。

上述环孢菌素A的高效液相检测方法，所述的环孢菌素A样品是指经过前处理的环孢菌素A发酵液样品，或者环孢菌素A发酵液提取过程中间样品，或者其它环孢菌素A样品。

应用本发明的检测方法，环孢菌素A和环孢菌素的同系物C、B、D完全分离，且主峰明显，分析时间缩短，选择性，分辨率、灵敏度高，重现性好，准确可靠。

附图说明

图1实施例1所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.177处为环孢菌素C，5.855处为环孢菌素B，9.034为环孢菌素D，7.782为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。

图2实施例2所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.181处为环孢菌素C，5.853处为环孢菌素B，9.036为环孢菌素D，7.771为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。

图3实施例3所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.186处为环孢菌素C，5.862处为环孢菌素B，9.039为环孢菌素D，7.785为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。

图4实施例4所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.065处为环孢菌素C，6.326处为环孢菌素B，9.073为环孢菌素D，7.687为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。

实施例1