[发明专利]大肠杆菌耐热性肠毒素STI突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物学、分子生物学与基因工程的相关实验方法与技术，属于微生物学、分子生物学与基因工程研究领域，特别是三种大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)的分泌型表达载体。

背景技术：

引起仔猪黄、白痢的致病菌为产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)，其致病因子主要为肠毒素和黏附素(adhesion)。肠毒素可分为耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)。耐热性肠毒素分为ST_I和ST_II，其中ST_I是最主要的直接致病因子。耐热性肠毒素有毒且几乎没有免疫原性，当其与载体蛋白共价偶联后，可表现出特异免疫原性。

ST_I在菌体内首先合成72个氨基酸的前体，ST_I前体由1～19个氨基酸前区、20～54个氨基酸后区和55～72个氨基酸成熟区组成。前区为ST_I类保守的领头肽，在ST_ImRNA翻译开始时便为信号肽酶所切割；后区在ST_I通过内膜进入细胞间质过程中有重要作用；要成为成熟ST_I，转运后的后区ST_I必须经过加工和分子内正确二硫键的形成。

成熟的大肠杆菌ST_I为18～19个氨基酸的多肽，ST_I含有13个高度保守的氨基酸序列(5～17个氨基酸)，这段氨基酸小肽保留了ST_I的完全毒性，为毒性区，具有与天然毒素相似的受体蛋白结合能力。保守区内的6个Cys组成Cys5-Cys10、Cys6-Cys14和Cys9-Cys173个分子内二硫键，对ST_I的生物毒性至关重要。因该键属于共价键，键能高，不易破坏，故分子结构高度稳定，因而耐热(在100℃30min和121℃15min不失活)、耐酸碱(在pH2～10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂；抗各种蛋白酶水解，为肽类毒素中最特殊者。不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活。

如果将二硫键破坏，就可以使ST_I失去生物学毒性。因此，本研究采用PCR和基因定点突变技术，将ST_I基因成熟区第10、14、17位的半胱氨酸(Cys)密码子TGT、TGT、TGC分别突变成编码甘氨酸(Gly)残基的密码子GGT、GGT、GGC密码子，成功获得了大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I的3种突变体(Cys→Gly)--ST_I C10/G、ST_I C14/G、ST_I C17/G及其分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17与相应的重组菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。从而为研究ST_I的结构与功能的关系、致病机理及开发新型仔猪腹泻基因工程疫苗奠定了坚实的基础。目前国内外尚没有与本研究成果相关报道。

发明内容：

本发明的目的是提供三种大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)的分泌型表达载体，从而为研究ST_I的结构与功能的关系、致病机理及开发新型仔猪腹泻基因工程疫苗奠定了坚实的基础。本发明的目的按照下述方案实现：

一种大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体，是以产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922所提取质粒为模板，利用引物分别进行重组PCR，扩增得到三种ST_I突变体--ST_IC10/G、ST_IC14/G和ST_IC17/G，继而将其克隆至pET-22b中，获得了相应的分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17与相应的重组菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。分泌型表达载体中，突变体基因核苷酸序列分别为：

突变体基因ST_IC10/G核苷酸序列：

GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA   60