[发明专利]赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽的制备方法及应用

权利要求书

1.赭曲霉毒素A高密度模拟表位肽作为固相竞争抗原在赭曲霉毒素A酶联免疫检 测分析中的应用，具体步骤在于：

(1)取纯化的高密度模拟表位蛋白，紫外分光光度计测定其在280nm的吸光值 A280nm，根据Warburg-christian公式：蛋白质浓度mg/ml＝1.55A280nm-0.76A260nm， 确定其蛋白浓度；

(2)采用方阵滴定确定高密度模拟表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗体的最佳使用浓 度；具体如下：

A、用pH7.2PBS磷酸缓冲溶液将高密度模拟表位蛋白配制成40、20、10、5、2.5、 1.25和0.625μg/ml的浓度，按每条酶标板一个浓度，每孔100μL加入酶标板中，4 ℃过夜；

B、倾去包被液，PBST洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干，每孔加入300μL 3％ 的以PBST为溶剂的脱脂牛奶作为封阻液，37℃保温保湿1小时；倾去封阻液，PBST洗 涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干；PBST为PBS加0.2％的吐温20；

C、将抗赭曲霉毒素A抗体用PBS倍比稀释成1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶ 8000、1∶16000、1∶32000和1∶64000的浓度，依次加入各条处理好的酶标板板孔 中，最后一孔加入PBS作空白对照，37℃保温保湿1小时；

D、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干；每孔加100μL辣根过氧化物酶标 记的抗抗体即酶标二抗，37℃，保温保湿1小时；

E、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干；每孔加OPD或TMB底物液100μL， 37℃保温保湿避光反应10分钟后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，以空白对照 孔调零，在酶标仪上测定酶标板492nm或450nm的吸光值，根据所有孔吸光值进行比 较，选择吸光值在1.5左右最低的高密度模拟表位蛋白包被浓度和最大的抗体稀释度 即为高密度模拟表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗体的最佳使用浓度；

(3)通过化学合成模拟表位多肽IRPMDVP，制作标准曲线确定合成模拟表位多肽 IRPMDVP与赭曲霉毒素A标准品的剂量关系，以之替代赭曲霉毒素A标准品，具体实 施如下：

A、根据方阵滴定确定的赭曲霉毒素A高密度模拟表位蛋白的浓度；高密度模拟表 位蛋白溶于0.1M pH8.6的NaHCO₃，100μL/孔，4℃包被过夜；

B、PBST洗板四次，3％脱脂牛奶300μL/孔4℃封闭2h；

C、PBST洗板四次，各孔分别加入不同浓度的赭曲霉毒素A标准品、合成模拟表 位多肽50μL，再全部加入方阵滴定确定的抗赭曲霉毒素A抗体50μL，振荡混匀，37 ℃保温保湿1h；

D、PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗抗体，量为100μL/孔，37℃ 作用1h；

E、洗涤6次；联苯二胺OPD显色，2M H₂SO₄终止反应，测定492nm波长光密度OD 值，计算各浓度的结合率，结合率％＝B/B₀×100％；B0为不加赭曲霉毒素A或不加合成 多肽的OD值，B为加赭曲霉毒素A或加入合成多肽的OD值；

F、根据赭曲霉毒素A的浓度和结合率绘制赭曲霉毒素A竞争抑制曲线，根据合成 模拟表位多肽的浓度和结合率绘制多肽竞争抑制曲线，通过参照标准曲线中相同结合 率可得出标准品赭曲霉毒素A与合成模拟表位多肽的剂量关系；

(4)高密度模拟表位蛋白作为竞争抗原替代赭曲霉毒素A人工抗原，合成模拟表 位多肽替代赭曲霉毒素A标准品用于ELISA检测，具体步骤如下：

A、根据方阵滴定确定的最佳高密度模拟表位蛋白浓度，用pH7.2PBS磷酸缓冲溶 液稀释，在酶标板中每孔加100μL高密度模拟表位蛋白，4℃过夜；

B、倾去包被液，PBST洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干，每孔加入300μL 3％ 溶于PBST的脱脂牛奶作为封阻液，37℃保温保湿1小时；倾去封阻液，PBST洗涤三次， 每次在厚叠吸水纸上扣干；其中PBST为PBS加0.2％的吐温20；

C、在酶标板各孔中加入浓度为40000，20000，10000，5000，2500，1250，625， 312.5，156，100，50和0pg/mL的合成模拟表位多肽或溶于35％甲醇PBS的待测样品 50μL，再全部加入以PBS稀释的抗赭曲霉毒素A抗体50μL，同时以PBST代替抗体 设置空白对照，37℃，保温保湿1小时；

D、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干，每孔加100μL辣根过氧化物酶标 记的抗抗体，37℃，保温保湿1小时；

E、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干；每孔加OPD或TMB底物液100μL， 37℃保温保湿避光反应10分钟后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，以空白对照 孔调零，在酶标仪上测定酶标板492nm或450nm的吸光值，计算各浓度的结合率，结 合率％＝B/B₀×100％，B₀为合成模拟表位多肽浓度为0时的吸光值，B为合成模拟表位 多肽各浓度的吸光值，同样计算各待测样品孔的结合率；B为待测样品孔的吸光值， 以各合成模拟表位多肽浓度的常用对数值1gC为横坐标，各浓度合成模拟表位多肽相 应的结合率为纵坐标制作竞争抑制曲线；

F、以各待测样品孔的结合率对应的纵坐标，查标准曲线对应的横坐标，再通过步 骤(3)确定的合成模拟表位多肽与赭曲霉毒素A标准品的剂量关系的标准曲线，即可 得出样品中赭曲霉毒素A的含量，或可用酶联免疫吸附检测方法专用分析软件对数据 进行分析得出结果；

其中赭曲霉毒素A高密度模拟表位肽依照下列步骤制备：

(1)模拟表位表达载体的构建及鉴定

根据赭曲霉毒素A的序列，用化学方法合成二条包含赭曲霉毒素A模拟表位及核 酸内切酶位点的核苷酸序列，以其中一模拟表位肽为例，

合成T1：5′-GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3′

和T2：5′-GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3′，加dd H₂O分别配成20pmol/ μl的寡聚核苷酸单链溶液，各取10μl混合后，置于PCR仪，65℃保温10min， 然后缓慢降温至室温，-20℃保存；

(2)序列导入、鉴定：

取PC89质粒DNA 32μl 30μg，加10×酶切buffer 4μl，10U/μl EcoRI  2 μl，10U/μl BamHI 2μl，37℃酶切2h，65℃20min灭活，2.5％琼脂糖电泳 观察结果；在紫外灯下迅速切下目的条带，用UNIQ₂₁₀胶回收试剂盒回收；将回收后的 PC89DNA片段与双链寡聚核苷酸连接；连接反应体系：双链寡聚核苷酸4μl，PC89载 体DNA 4μl，10U/μl T4DNA ligase 1μl，10×T4 DNA ligation buffer 1μl， 总体积10μl，16℃连接过夜；连接液全量转化大肠杆菌感受态细胞，热激后涂布已 加入40μl 4mg/ml X-gal及4μl 40mg/ml ITPG的含Amp的LB平板，37℃培养 过夜，挑单菌落扩增细胞进行阳性克隆鉴定；

(3)高密度模拟表位蛋白的表达：

经鉴定后的阳性克隆挑单菌落接种于2ml Amp+Tet双抗SOC培养液中，37℃振 荡培养2h，转移至400ml Amp+Tet双抗SOC培养液中，37℃振荡培养至A600约 0.4时，加入1×10¹²PFU的VCSM13，37℃振荡培养1h，再加入终浓度为70mg/L 的卡那霉素以及终浓度为1mmol/L的ITPG，37℃振荡培养过夜；

(4)高密度模拟表位蛋白的纯化：

将培养液4℃10000rpm离心10min，上清液加入PEG/NaCl，4℃沉淀过夜；4℃ 10000rpm离心15min，去上清，再用1mL TBST悬浮噬菌体，加入PEG/NaCl冰上孵 育60min；4℃离心15min，去上清，沉淀用200μl TBST悬浮并测滴度，4℃保存。